P2、G4型轮状病毒引起产科新生儿腹泻暴发流行
中华儿科杂志 1999年第5期第37卷 论 著
作者：钱渊 张又 肖玮 李国华 吴婉芳 杨松 孙爱平 万理 赵玉芳
单位：100020北京, 首都儿科研究所北京感染与免疫中心实验室（钱渊、张又、肖玮、李国华、吴婉芳、杨松）; 北京医院产科（孙爱平、万理、赵玉芳）
关键词：腹泻；婴儿；轮状病毒感染；基因；病毒
【摘要】 目的 查明1997年11月在北京医院产科母婴同室病房发生的新生儿腹泻暴发流行的病原。方法 对患儿的粪便进行了细菌培养及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，并进一步采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增标本中检测到的轮状病毒VP7全基因及VP4基因，再用巢式PCR和核酸杂交分别对扩增得到的VP7及VP4基因进行分型。结果 采集到的9例腹泻患儿的粪便标本中显示完全一致的A组轮状病毒核酸图型，而4例无腹泻症状的新生儿粪便标本3例为阴性，1例为阳性（经随访，该例患儿出院后发生腹泻），表明这是一次由轮状病毒引起的新生儿腹泻流行。此次新生儿腹泻标本中检测到的轮状病毒均为VP4 2型（P2）、VP7 4型（G4）型，不同于从同期门诊收集到的婴幼儿腹泻标本中的轮状病毒。结论 通常认为P2型轮状病毒是无毒株或减毒株，仅引起新生儿的无症状感染，而作者的研究证明：（1）此次新生儿腹泻暴发流行的病原为轮状病毒是独立的病原；（2）P2型轮状病毒可以引起较严重的新生儿腹泻的暴发流行。这是国内外首次报告由P2型轮状病毒引起新生儿病房内腹泻的暴发流行，对该病毒株的更深入的分子生物学研究将进一步进行。
An Outbreak of neonatal diarrhea caused by a rotavirus with specificity of P2, G4 in an obstetric rooming-in ward. QIAN Yuan, ZHANG You, XIAO Wei, et al. Municipal Laboratory of Infection and Immunity, Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020
【Abstract】 Objective To identify and characterize the etiological agent of the diarrhea outbreak.Methods Stool specimens were collected from 9 newborn babies with diarrhea and 4 without diarrhea and the polyacrylamide gel electrophoresis was used to identify rotavirus dsRNA. For those rotavirus positive specimens, the genes of VP4 and VP7 were characterized by RT-PCR amplification and followed by nested PCR (for VP7 gene) and dot blot hybridization (for VP4 gene).Results Identical rotavirus dsRNA patterns were detected from the those 9 specimens from babies with diarrhea, whereas out of those 4 specimens from babies without diarrhea, 3 were rotavirus negative and one was positive. The baby with rotavirus positive stool developed diarrhea after discharge from the hospital. All the rotaviruses identified from the outbreak were found to have the specificity of VP4 type 2 (P2) and VP7 type 4 (G4).Conclusion The data suggested that this outbreak of neonatal diarrhea was caused by rotavirus with the types of P2 and G4, which had been thought to cause asymptomatic infections in neonates in previously published literatures.
【Key words】 Diarrhea, infantile Rotavirus infections Genes, viral
轮状病毒是世界各地婴幼儿腹泻最重要的病毒病原，主要在秋冬季节引起两岁以内婴幼儿的严重腹泻，也可造成医院内的感染［1］。据文献报道，世界各地均有新生儿病房内的轮状病毒院内感染，但多为隐性感染或轻度感染，但意大利曾报告一起由轮状病毒感染引起的医院内新生儿腹泻暴发流行［1，2］。1997年11月北京医院产科母婴同室病房内发生了一次新生儿腹泻的暴发流行，经核酸电泳检测证明是由轮状病毒引起的。本研究仅对引起此次腹泻流行的病原进行了分析。
资料和方法
一、临床资料
1997年11月5日～1997年11月25日，在北京医院产科共出生正常新生儿48例，这些新生儿生后均为母婴同室。其中有18例患病，占同期出生新生儿总数的38%（18/48）。18例患儿中有15例发病集中在1周内，另3例为此前散发病例。18例患儿起病多在生后2～3天，15例以发热为首发症状，最高达40℃, 发热48～72小时内出现腹泻；另3例无前驱症状，突发腹泻。表现为水样便，每天10～20余次。重症患儿每次大便湿重可达120～150 g，恢复期患儿多为均质稀便。18例中有2例并发呕吐，5例重度脱水，10例轻度脱水。
二、实验室检查
1.18例患儿粪便标本常规镜检并进行细菌培养。脱水患儿行生化检查。
2.18例腹泻患儿中有9例采集到粪便标本，另采集同期出生的4例无症状新生儿粪便标本。用1% 十二烷基磺酸钠（SDS）、56℃ 30分钟处理，酚-氯仿抽提提取病毒核酸后，用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测［3］。
3.轮状病毒VP4及VP7型别的鉴定：首先用RT-PCR分别扩增VP7及VP4基因，然后用巢式PCR确定VP7型别，用核酸杂交确定VP4型别。(1) RT-PCR：用RT-PCR分别扩增轮状病毒阳性标本中VP7及VP4基因，方法见文献［4，5］。VP7基因5′末端和3′末端引物5′-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGT CTGG-3′(1-28)、5′-GGTCACATCATACAATTCTAA TCTAAG-3′(1062-1036)用于扩增VP7全基因（1 063 bp），引物5′-TGGCTTCGCCATTTTATAGACA-3′(11-32)、5′-ATTTCGGACCATTTATAACC-3′(887-868)用于扩增VP4基因中可确定型别的特异性片段（857 bp）。所用AMV逆转录酶、Taq DNA聚合酶购于GIBCO BRL公司，dNTP购于保灵曼公司。(2)巢式PCR确定VP7基因型别：将RT-PCR扩增所得VP7全基因cDNA作为模板进行再次PCR，所用引物包括3′末端公用引物及根据1、2、3、4、8、9型VP7基因的特异序列所设计的引物，这些引物与VP7基因不同位置结合。根据PCR扩增产物的大小不同可确定VP7的型别，具体方法见文献［4，5］。(3)核酸杂交确定VP4基因型别：采用打点杂交，所用探针分别从轮状病毒我国地方株P1A、P1B、P2型VP4基因重组质粒（已经核苷酸序列测定）中进一步扩增［6］。采用引物：5′-GATGGTCCTTATCAACC-3′(205-221)、5′-CATTACACTTAGATTCTTG-3′(658-640)将上述质粒进行PCR扩增，扩增产物为最具有型特异性的VP4基因片段(453 bp)［6］，在PCR扩增时将地高辛标记的dNTP（保灵曼公司产品）掺入PCR扩增产物。将RT-PCR从粪便标本中扩增所得VP4基因片段（1～2 ng）点于尼龙膜（S&S公司产品），经碱变性、预杂交，然后加入探针(杂交液含50%甲酰胺)，42℃杂交过夜，用保灵曼公司地高辛检测试剂盒检测。每批杂交设P1（P1A、P1B）、P2已知阳性质粒对照、已知阳性标本及已知阴性标本对照。
4.收集同期（1997年11月中下旬）门诊婴幼儿腹泻患儿粪便标本，用上述相同方法检测轮状病毒核酸，并作VP7及VP4基因型别鉴定。
结 果
一、一般检查
粪便常规镜检均无异常。细菌培养致病菌均为阴性。5例重度脱水患儿血生化均为高渗性脱水。
二、10%PAGE检测结果
9例患儿标本均呈现完全一致的A组轮状病毒核酸图型（图1），而同期采集的4例无腹泻症状新生儿的粪便标本中3例未检测到轮状病毒核酸，有1例检测到轮状病毒核酸且图型与患儿标本中的一致，经随访该患儿出院后发生腹泻，而3例阴性患儿无1例发生腹泻，证明此次腹泻流行由轮状病毒引起。同期收集的门诊腹泻患儿标本中的轮状病毒核酸图型与新生儿标本中不一致，且显示多样的核酸图型（图1）。提示本次新生儿腹泻流行的病原虽为轮状病毒，但似与外界的轮状病毒感染无关。
不连续聚丙酰胺凝胶电泳,浓缩胶为3%,分离胶为10%,电泳后硝酸银染色1～3、12、14为同期门诊腹泻患儿粪便标本, 4～11为此次新生儿腹泻粪便标本, 13为λDNA/HindⅢ
图1 粪便标本中轮状病毒核酸电泳图
三、临床转归
经过补液、纠正酸中毒、止泻等处理，所有患儿在病程3～7天痊愈出院。经随访，未再有异常情况和其它并发症。
四、VP7型别
经巢式PCR鉴定，此次新生儿腹泻标本中检测到的10例轮状病毒均为VP7 G4型，而同期在门诊收集到的腹泻患儿标本中检测到的轮状病毒为VP7 G1型、G2或G3型。说明此次新生儿腹泻暴发流行虽发生于轮状病毒感染高峰季节，但是确与外界轮状病毒感染无关。这是一次孤立的新生儿轮状病毒感染在母婴同室病房中的暴发流行。
五、VP4型别
打点杂交结果显示，此次新生儿腹泻中检测到的轮状病毒的VP4基因均属P2型，也即通常认为引起新生儿隐性感染的无毒株的VP4型别，而同期在门诊收集到的标本中的轮状病毒，无论其VP7属G1、G2或G3型，VP4均属P1型（P1A或P1B）。再次证明此次新生儿腹泻的病原不同于同时期外界的轮状病毒。
讨 论
一、轮状病毒感染与新生儿腹泻
无论在发达国家还是发展中国家，轮状病毒都是引起婴幼儿严重腹泻的最重要的病原［1］。据国外文献报道，轮状病毒也可引起新生儿（尤其是产科中新生儿室或新生儿病房内）感染，但通常是无症状的［1，7］，国内也有轮状病毒引起新生儿腹泻的报告。
二、轮状病毒的分型
根据轮状病毒组特异抗原VP6抗原性的不同，目前已将轮状病毒分为七个组（A→G），引起婴幼儿腹泻的主要是A组轮状病毒。以往根据中和抗原的不同，将A组轮状病毒分为1～4血清型。随着研究的不断深入，不仅发现了更多的感染人的血清型（如8、9血清型等），随着分子生物学手段运用于轮状病毒的研究，还发现了血清分型的分子基础:轮状病毒的两个主要外壳结构蛋白VP4和VP7均可刺激机体产生中和抗体，并分别与轮状病毒的血清学反应有关。因此，目前根据VP4和VP7抗原的差异，确立了两个独立的分型系统:因VP7是一个糖蛋白（glycoprotein, G），因此将根据VP7分型称为G血清型；而VP4是一个蛋白酶(proteinase ,P）敏感蛋白，因此根据VP4分型称为P血清型［1］。
轮状病毒属呼肠孤病毒科，基因组为分11个节段的双链RNA(dsRNA)，其第4和第9基因分别编码病毒的外壳蛋白VP4和VP7，可作为轮状病毒分型的依据（VP4决定P血清型，VP7决定G血清型），常用作分子流行病学研究［1］。我们运用RT-PCR从此次腹泻新生儿粪便标本中扩增了轮状病毒的VP4和VP7基因，并分别用核酸杂交和巢式PCR确定了VP4和VP7型别，证明此次新生儿腹泻的暴发流行是由通常认为无毒或减毒型的P2（VP4）、G4（VP7）型毒株引起的。
三、引起新生儿腹泻的轮状病毒的分型
分子流行病学研究证明，引起新生儿隐性感染的轮状病毒株，无论其VP7属1、2、3或4型，其VP4的型别是共同的，它的基因不同于引起婴幼儿腹泻毒株的VP4（P1A或P1B），而是都属于P2型。因此认为P2型的轮状病毒株是自然减毒株，已考虑用其作为疫苗株（代表株为M37）［1］。而唯一报告轮状病毒引起的新生儿病房中腹泻暴发流行的毒株，其VP4属于P1型、VP7属4型，因此考虑是由成人将外界婴幼儿腹泻的轮状病毒传入新生儿病房［2，8］。
本研究所报告的新生儿腹泻发生在产科母婴同室病房，又处在轮状病毒感染的高峰季节。为了明确病原是否由外界传入，我们采集了同一时期门诊婴幼儿腹泻的粪便标本，核酸电泳显示门诊患儿标本中轮状病毒的dsRNA电泳图型与新生儿标本中的有明显差异，并且呈现多样性，提示此次新生儿腹泻的病原并非由外界传入，而是有独立的同一的传染源。为了进一步证明这一点，我们对新生儿及门诊患儿中发现的轮状病毒分别进行了VP7及VP4基因的型别分析，结果证明新生儿标本中的轮状病毒均为VP7 4型（G4）、VP4 2型（P2），而门诊患儿标本中的轮状病毒无论其VP7为1型、2型或3型，VP4均为P1型。这些结果证明：（1）此次新生儿腹泻暴发流行的病原为轮状病毒；（2）从基因水平证明了此次新生儿腹泻的暴发流行与同一时期外界散发流行的婴幼儿轮状病毒腹泻无关，而是独立的病原；（3）P2型轮状病毒可以引起较严重的新生儿腹泻的暴发流行。以往报告普遍认为的P2型轮状病毒为自然减毒株，仅引起新生儿无症状性感染的提法值得进一步深入研究。
这是国内外首次报告由P2型轮状病毒引起新生儿病房内腹泻的暴发流行。轮状病毒是分11个节段的双链RNA病毒，最近有研究提示其它非结构蛋白可能与病毒的毒力及致病性有关，我们将从分子水平对这些病毒进行全面的分析。
志谢 首都儿科研究所照像室胡小明为本文印制照片，特此志谢
本课题由国家自然科学基金资助(基金项目编号:39570036)、卫生部科研基金资助（基金项目编号:1385·312）和北京市自然科学基金资助（基金项目编号：7951002）
参考文献
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(收稿：1998-07-17 修回：1998-09-17)
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