呼吸道合胞病毒感染对哮喘患儿单个核细胞表达白细胞介素4和5的影响

中华结核和呼吸感染 1999年第4期第22卷 论　著

作者：黄海鹭　常汝虚　冉丕鑫　钟南山

单位：黄海鹭、冉丕鑫、钟南山(510120 广州，广州呼吸疾病研究所)；常汝虚(广州市儿童医院病毒室)

　　关键词： 哮喘；呼吸道合胞病毒；白细胞介素类；嗜酸细胞阳离子蛋白

　　【摘要】　目的　观察呼吸道合胞病毒(RSV)感染对哮喘患儿螨诱导单个核细胞(PBMC)表达白细胞介素4(IL-4)和IL-5的影响及其与哮喘的关系。方法　用酶联免疫吸附试验(ELISA)及逆转录(RT)-聚合酶链反应(PCR)法分析了30例螨过敏哮喘患儿［其中RSV感染者16例(A组)，无RSV感染者14例(B组)］和10名年龄匹配的正常对照组(C组)的外周血PBMC经螨诱导表达IL-4及IL-5的水平，并分析其与血清嗜酸细胞阳离子蛋白(ECP)浓度及哮喘症状的关系。结果　(1)B组螨诱导PBMC IL-4［(34±24) ng/L］和IL-5的分泌结果和IL-5［(26±15) ng/L］的分泌与C组的IL-4［(8±5) ng/L］的分泌比较，差异有显著性(P均＜0.01)，同时螨诱导IL-5的分泌结果和IL-5［(6±5) ng/L］呈剂量依赖关系。A组的PBMC经螨刺激后IL-5的释放水平［(68±43) ng/L］与B组比较，差异有显著性(P＜0.05)。两组IL-5 mRNA表达量与IL-5蛋白水平的变化相似。(2)A组患者的血清ECP水平［(73±47) μg/L］与C组［(18±12) μg/L］比较，差异有显著性(P＜0.01)，抗原诱导IL-5释放水平与血清ECP水平呈显著正相关(r=0.49，P＜0.05)。(3)有喘息症状者的IL-5水平［(71±40) ng/L］与无喘息症状者［(34±29) ng/L］比较，差异有显著性(P＜0.05)。结论　RSV感染后过敏哮喘患儿，其PBMC IL-5表达增加，可能是造成活化型嗜酸细胞增多和症状加剧的原因。

Mite-induced interleukin-5 and interleukin-4 expressions in peripheral blood mononuclear cells from asthmatic children with respiratory syncytial virus infection

　　Guangzhou Institute of Respiratory Disease, Guangzhou, 510120

　　【Abstract】　Objective　To investigate the effects of respiratory syncytial virus(RSV) infection on mite-induced interleukin-5 and interleukin-4 expressions in cultures of PBMC from asthmatic children and their correlation with asthmatic symptoms.Methods　IL-5 and IL-4 expressions in mite (D. Pteronyssinus) -stimulated PBMC were assessed ex vivo by ELISA and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) in 16 allergic asthmatic children with RSV infection(A) and 14 patients without RSV infection(B), as well as 10 normal controls(C) (5.1±2.4 yrs). Meanwhile their correlation with serum ECP or current wheezing was analysed in patients after RSV infection.Results　(1) Stimulation of PBMC with mite antigens induced significantly higher IL-4 ［(34±24) ng/L vs (8±5) ng/L, (P＜0.01)］ and IL-5 ［(26±15) ng/L vs (6±5) ng/L］ release in allergic patients(B) as compared with healthy controls(C). The release was in a mite dose-dependent manner. Meanwhile, IL-5 level in group A (A) was the highest (73±47) ng/L, P＜0.05 compared with (B)). Similar results were obtained with IL-5 mRNA expressions. (2)Serum ECP level was significantly higher in group A ［(73±47) μg/L］ than in group C ［(18±12) μg/L, P＜0.01］. There was a significant correlation between IL-5 release and ECP levels (r=0.49, P＜0.05). (3) Mite-induced IL-5 release in PBMC was significantly increased in the group with wheezing symptom ［(71±40) ng/L compared with the asymptomatic group (34±29) ng/L, (P＜0.05)］.Conclusions　Our findings indicated that during RSV infection, mite-induced IL-5 expression in PBMC of asthmatic children was up-regulated, which may enhance activation of eosinophils and precipitate or exacerbate asthma symptoms.

　　【Key words】　Asthma　　Respiratory syncytial virus　　Interleukins　　Eosinophil cationic protein

　　目前的研究表明，哮喘是一种与机体特异质密切相关的疾病。从某个角度来说，特异质是一种潜在的过敏反应状态，其中吸入性抗原以及病毒感染是哮喘发生及发展过程中的两个重要触发因素，这种关系在哮喘儿童尤为明显。因此，探讨病毒诱导性炎症及抗原诱导性炎症之间的关系将有助于对哮喘发病机制的了解。许多研究提示，大量的细胞因子参与了哮喘气道炎症的发生，其中活化的淋巴细胞释放白细胞介素(IL-4)、IL-5等TH₂样反应发挥着重要作用。呼吸道合胞病毒(RSV)是与哮喘发生非常密切的病毒之一，我们的研究通过观察RSV感染后哮喘患儿抗原诱导淋巴细胞释放IL-4和IL-5的变化，从而探讨病毒感染对过敏性哮喘发生的影响。

　　对象与方法

　　一、对象

　　1997年5～9月收治的螨特异性IgE阳性支气管哮喘患儿30例，年龄2～10岁，其中支气管哮喘伴RSV感染者16例(A组)，这些患者均曾有不同程度的咽痛、发热等感染症状，临床提示感染并符合RSV感染的测定条件；螨过敏无感染的患儿14例(B组)，此组患儿临床无明显的感染症状。无感染、螨特异性IgE阴性，对照组儿童10名(C组)，年龄匹配的健康体检儿童。

　　二、方法

　　1.RSV感染的测定：分别在急性期和恢复期收集血清样本用酶联免疫吸附试验(ELISA)法和RSV中和试验进行RSV抗体检测，当抗体的滴度升高4倍以上，或当单份血清样本的抗体滴度至少1∶64时判断为RSV感染。

　　2.螨特异性IgE及血清ECP测定：采用酶联荧光免疫法在Pharmacia CAP系统中按药盒说明书进行。37℃下静脉凝血1小时，离心分离血清进行ECP测定^［1］。

　　3.户尘螨对单个核细胞(PBMC)刺激培养：取肝素抗凝血5 ml，用密度梯度法在淋巴细胞分离液(上海试剂二厂产)上分离外周血PBMC，用RPMI 1640将细胞数调为(2～3)×10⁶/ml，加入10 μg/ml的户尘螨(BENCARD，英国)，在24孔培养板中37℃，5% CO₂培养24～48小时，离心取底层细胞用于逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析，上清冻干用于测定细胞因子水平。

　　4.RNA的提取：上述细胞离心1 000 r/min，5分钟，取底层细胞冼涤后，参照文献［2］用异硫氰酸胍∶酚∶氯仿一步法提取细胞总RNA。得到的RNA沉淀用焦碳酸二乙酯(DECP)处理水溶解，经乙二醛1%的琼脂糖凝胶电泳(含0.5 μg的溴化乙锭)鉴定，紫外分光光度计测定总RNA浓度，吸光度A(曾称光密度OD)260 nm/A280 nm为1.8～2.0之间，-40℃冰箱保存。

　　5.RT-PCR：RT-PCR参照文献［3］进行。提取的总RNA用美国Promega的逆转录试剂盒逆转录合成cDNA后，用于半定量PCR扩增。IL-5及β肌动蛋白(β-Actin)引物由上海Sangon公司合成。2条引物序列分别为IL-5：5′GCTTCTGCATTTGA-GTTTGCTAGCT；和TGGCCGTCCCCAATGTATTTCTTT-ATTAA3′，β-Actin是5′ATGGATGATGATATCACCGCG；和CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGCAGGGGCC3′。PCR扩增后，取样10 μl于2%的琼脂糖凝胶中电泳检测，电泳条带经密度扫描仪扫描，得到IL-5条带和β-Actin条带各自的峰面积积分值，计算各个样品的IL-5/β-Actin比值。

　　6.IL-5和IL-4的测定：采用ELISA法，试剂盒是美国Genzyme公司生产(深圳晶美生物工程公司提供)，按试剂盒说明书操作，在美国BIO-RAD全自动酶标分析仪上测定。

　　7.统计学处理：数据以±s表示，各组结果用非配对t检验或直线相关系数分析。

　　结　果

　　一、RSV感染对螨抗原刺激PBMC分泌IL-4，IL-5及血清ECP水平的影响

　　螨特异性IgE阳性的B组哮喘患儿螨诱导PBMC IL-4、IL-5的分泌显著高于螨特异性IgE阴性的C组患儿，这种诱导释放呈剂量依赖性(图1)。有RSV感染的螨过敏哮喘患儿(A组)，螨诱导PBMC IL-5的释放水平显著高于无RSV感染的螨过敏患儿，但螨刺激IL-4分泌水平升高未达到统计学差异。另外，RSV感染后哮喘患儿的血清ECP水平显著高于正常对照组(表1)。

图1　不同浓度的户尘螨诱导RSV感染的A组，B组及C组

　　患者外周血PBMC释放IL-5水平的变化

表1　RSV感染对螨抗原刺激PBMC分泌IL-4、IL-5及血清ECP水平的影响(±s)

注：与C组比较^*P＜0.01；与B组比较^△P＜0.05

　　二、RSV感染后抗原诱导IL-5释放与血清ECP水平及喘息症状的关系

　　RSV感染后抗原特异性IL-5释放水平与血清ECP呈显著正相关(r=0.497 4，P＜0.05，图2)。根据RSV感染后是否出现喘息症状，比较抗原特异性IL-5释放与喘息的关系，发现具有喘息症状患儿的IL-5水平［(71±40) ng/L)］显著高于无喘息症状的患儿［（34±29) ng/L，t=3.04，P＜0.05］。

图2　户尘螨诱导RSV感染的哮喘患儿PBMC释放IL-5水平与血清ECP浓度的关系

　　三、RSV感染后螨抗原诱导细胞产生IL-5基因表达的变化

　　螨抗原刺激培养前PBMC IL-5的mRNA表达量很低，螨刺激培养后，螨特异IgE阳性患儿IL-5 mRNA(IL-5/β-Actin)的表达量(0.81±0.37)显著高于对照组(0.17±0.31，P＜0.01)。而RSV感染后的哮喘患儿IL-5 mRNA的表达量(1.23±0.50)显著高于无RSV感染螨特异性IgE阳性组(0.8±0.37，P＜0.05，图3)。

M是DNA分子量参照物λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ Markers

　　图3　三组受检患儿PBMC在螨刺激下IL-5基因的表达

　　讨　论

　　本组研究发现，许多哮喘儿童螨特异性IgE阳性。当这些患儿的淋巴细胞与抗原一起培养时，IL-4及IL-5的表达量明显增高，这一结果证实TH₂细胞的活化与哮喘过敏性炎症的发生机制有密切的关系。然而，一些过敏性疾病的患者也可出现类似反应。但不是所有过敏的人都会发生哮喘。有报道哮喘发作期RSV及鼻病毒的检出率为26%～64%，而哮喘缓解期这些病毒的检出率仅有3%^［4］。Welliver等^［5］测定到RSV特异性IgE抗体，提示RSV感染有可能引起TH₂细胞的活化。另外RSV毛细支气管炎的患儿其父母有变态反应性疾病者发展成哮喘的可能性较大^［6］，提示变态反应性疾病与病毒感染在哮喘发生中的关系，但是这些研究存有争议。本组观察结果显示，RSV感染的哮喘患儿螨诱导淋巴细胞的IL-5表达不仅显著高于正常对照组，而且还显著高于螨过敏的患儿，提示RSV感染加剧了哮喘的TH₂细胞因子反应。

　　ECP是反应嗜酸细胞活化的指标，有研究显示，RSV毛细支气管炎患儿鼻咽分泌物中的ECP浓度显著高于非RSV感染的患儿^［7］，本组研究结果也显示，这些患者的血清ECP水平显著增高，RSV感染后IL-5水平的增高与患儿的喘鸣症状及血清ECP水平增高有关，因此可以推测，RSV感染后这种IL-5释放能力异常增高而加重哮喘TH₂细胞因子分泌的失衡及嗜酸细胞的活化是病毒诱发或加剧哮喘发作的原因之一。

　　参考文献

　　1　黄海鹭，孙宝清，李靖，等. 37℃凝血温度下正常人和哮喘患者血清ECP水平的测定.中华微生物学和免疫学杂志, 1997，17：394-396.

　　2　Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem,1987,162: 156-159.

　　3　Lai CK, Ho AS, Chan CH, et al. Interleukin-5 messenger RNA expression in peripheral blood CD⁺₄ cells in asthma. J Allergy Clin Immunol,1996, 97: 1320-1328.

　　4　Sigurs N, Bjarnason R, Sigurbergsson F, et al.Asthma and immunoglobulin E antibodies after respiratory syncytial virus bronchiolitis: A prospective cohort study with matched controls. Pediatrics, 1995, 95: 500-505.

　　5　Welliver RC, Wong DT, Sun M, et al.The development of respiratory syncytial virus-specific IgE and the release of histamine in nasopharyngeal secretions after infection. N Engl J Med, 1981, 305 : 841-846.

　　6　McConnochie KM,Roghmann KJ. Predicting clinically significant lower respiratory tract illness in childhood following mild bronchiolitis. Am J Dis Child, 1985, 139: 625-631.

　　7　Garofalo R, Kimpen JL, Welliver RC, et al. Eosinophil degranulation in the respiratory tract during naturally acquired respiratory syncytial virus infection. J Pediatr, 1992, 120: 28-32.

(收稿：1998-09-31　修回：1998-11-22)