狂犬病毒CTN-1株在Vero细胞中的复制周期的观察

中华实验和临床病毒学杂志 1998年第3期第12卷 简报

作者：董关木　孙光　郑海发　俞永新

单位：100050　北京　中国药品生物制品检定所

　　病毒的复制过程是很复杂的。研究病毒的复制过程是大多数实验病毒学家关注的焦点^〔1〕，这对病毒的致病性、潜伏期、病毒的诊断、疫苗生产中毒种接种量、培养时间、收获时间都非常重要。我们对CTN-1毒株在Vero细胞中感染、吸附和复制周期进行了初步研究。

　　1　材料和方法

　　将分离自我国济南并已适应于Vero细胞的CTN-1毒株^〔2，3〕接种Vero细胞，观察其吸附以及复制情况^〔4〕。首先制备实验用毒种，并以半微量蚀斑形成法正确滴定其滴度，方法按文献〔5〕。CTN-1对Vero细胞吸附时间的确定和复制周期的确定是将经蚀斑法精确滴定的病毒液与经精确计数的感染的靶细胞(Vero细胞)进行稀释调整至1.0MOI和0.1MOI两种感染比例，一经病毒液与细胞液混匀接触即开始计时为零分钟，依次分别在0、10、20、30、45和60分钟时取样迅速离心，上清液于-70℃冻存，以备测定吸附后的残留病毒量；已吸附病毒的细胞离心沉淀再用培养液离心沉淀洗3次，继续培养至7天后测定病毒滴度，以证实细胞已吸附病毒。

　　病毒与Vero细胞经37℃吸附半小时，去掉残存的上清病毒液，细胞用MEM培养基洗涤3次，最后加入3%牛血清的MEM培养基分装小管，置37℃培养，分别经半小时、1、2......直至7天共23个时间点取样，每次取一小管，取样后上清液作为细胞外分泌病毒样品存于-70℃；细胞经MEM洗涤3次，冻存于-70℃。滴定时冻融3次。裂解细胞，使细胞内病毒释放，按文献〔2〕检测病毒滴度。

　　2　结果

　　CTN-1株对Vero细胞的吸附作用极强，一经接触就大量吸附。从表1可见，用0.1MOI吸附，10分钟即可有99%以上的病毒吸附，而按1.0MOI吸附时，上清液中不能吸附到细胞上的病毒很多，直至60分钟以后才能使98%以上的病毒得以吸附。

　　细胞与病毒经37℃分钟后，去残余病毒并洗涤3次，再37℃继续培养。结果细胞内病毒在60分钟时仍能检测到，到120分钟时已测不到感染性病毒，但在16小时后，细胞内病毒可达Log 3.6 PFU／1ml。细胞外液中17小时已能测定到感染性病毒，黑暗期小于16小时。此后病毒继续上升，4天到高峰，并维持到第7天。对细胞外液检测发现，在感染后16小时，病毒已有释放，滴度可达Log 1.74PFU／ml，在第7天达高峰，结果见图1和表2。

　　图　1　狂犬病毒(CTN-1株)在Vero细胞中的复制动态

　　Fig.1　The dynamics of Rabies virus(CTN-1)replication in Vero cells

　　3　讨论

　　实验结果表明，CTN-1病毒株在Vero细胞中的复制周期短于16小时。此外，细胞内亦有相当高的具有感染性的病毒颗粒，在相同时间内其滴度均较细胞外高。在72小时细胞内外比例基本平衡。这和细胞外病毒积累有关。72小时以后病毒滴度不再增高，可能是细胞开始衰老，向外释放病毒量减少同时先前释放的病毒也逐步失去活性。因此我们认为，病毒在37℃和此培养条件下的存活期可能是72小时。因细胞外的病毒在不断释入，也不断有病毒失去感染性，故，如制备感染用毒种，以培养至3～4天收获为宜。这样死病毒较少的条件下感染细胞时容易一次性达到最大感染量，不被死病毒干扰。此外我们还发现，细胞内亦有较大量的感染性病毒。由于细胞内病毒是不完全病毒，尚缺乏宿主细胞的质膜 ，即病毒G蛋白^〔6〕。G蛋白是诱生中和抗体的病毒成分，最近对狂犬病毒核蛋白基因序列的测定及其免疫功能的研究，逐渐注意到它在预防上的作用。对Vero细胞内未释放到细胞外的病毒是否有免疫功能尚不清楚，如能确定其免疫功能，将为制备疫苗提供更多的病毒原材料。

表　1　狂犬病毒(CTN-1)不同时间对Vero细胞的吸附率

Tab.1　Adsorption rate of Rabies virus (CTN-1)to Vero cells at different times

　　Ⅰ：不同时间吸附后上清液中的残余病毒量；Ⅱ：病毒原始毒力减Ⅰ以后推算的吸附量与原始病毒滴度相比的百分率；Ⅲ：吸附病毒后Vero细胞37℃培养7天后所滴定的病毒量Ⅰ：Virus in supernatant after various time adsorption with Vero cells; Ⅱ: The percentage of adsorbed virus calculated by subtracting I from original virus to the original virus titer.Ⅲ: Virus titer in Vero cells cultured in 37℃ for 7days after virus adsorption

　　表　2　狂犬病毒(CTN-1)在Vero细胞中的复制动态

　　Tab.2　The replication of Rabies virus(CTN-1)in Vero cells

　　注：“-”为未见蚀斑形成

　　note:"-"indicates no plaque forming

参　考　文　献

　　1　Dianzani F, Antonelli G, Capolianchi M R,et al.Replication of human immunodeficiency virus:yield of infectious virus under single growth cycle conditions.Arch Virol,1988,103:127-131.

　　2　董关木，聂子林，姚智慧，等.流行性出血热病毒在Vero E6细胞内引起细胞病变的新发现，病毒学报，1990，6(1)：81-84.

　　3　董关木，刘增顺，俞永新，等.狂犬病毒CTN-1株在Vero细胞上的适应研究.微生物学免疫学进展，1995，23(2)：82-85.

　　4　WHO. Expert Committee on Biological Standardization,31th report series.1982,No.658,p54.

　　5　聂子林，曲小素，俞永新，等.狂犬病毒快速HEPES蚀斑方法的建立.中华微生物学和免疫学杂志，1993，13(4)：268-270.

　　6　卢锦汉，章以浩，赵铠，等.医学生物制品学.北京：人民卫生出版社，1995，556-557.

　　7　Jame S, Alan B.A collaborative study on DNA quantitation in biological products. Biologicals,1995,23:199-205.

　　8　Wiernga D E,Cogan J, Potricciani J C.Administration of tumor cell chromatin to immunosuppressed and non-immunosuppressed non-human primates.Biololgical,1995,23:p.221-224.

　　1997年8月2日收稿　12月25日修回。