大肠肿瘤中细胞核形态参数和p53、PCNA表达的定量研究
安徽医科大学学报 2000年第4期第35卷 临床医学研究
作者：陈金璋 曹立宇 张洪福
单位：陈金璋（安徽省界首市第一人民医院病理科， 236500）；曹立宇 张洪福（安徽医科大学病理解剖教研室，合肥 230022）
关键词：结直肠肿瘤；基因；p53；PCNA；形态计量
摘要 目的 研究大肠肿瘤中细胞核形态参数和p53、PCNA定量表达的关系。方法 应用免疫组化和图像分析技术对40例腺瘤、80例腺癌及15例正常粘膜细胞核形态参数和p53、PCNA含量进行研究。结果 腺瘤及腺癌中核面积、核周长、核平均直径均大于正常粘膜(P＜0.05，P＜0.01)，腺癌组p53及PCNA相对含量均高于腺瘤组(P＜0.05)。PCNA表达与大肠癌的差分化有关(P＜0.05)。核面积及核平均直径与腺瘤及腺癌中PCNA及p53含量正相关，与腺瘤及腺癌组织学类型无关。结论 检测大肠肿瘤中核形态参数和p53、PCNA相对含量有助于大肠癌早期诊断和判断预后。
中图分类号 R735.2
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)04-0314-02
研究认为p53基因突变及细胞异常增殖在大肠肿瘤发生中起重要作用，我们应用免疫组化及图像分析技术对大肠肿瘤p53、PCNA蛋白表达含量及细胞核形态参数进行定量研究，探讨p53及PCNA表达与细胞形态参数的关系及其在大肠肿瘤发生中的作用及其临床意义。
1 材料和方法
1.1 材料 收集界首市第一人民医院及安徽医科大学第一附属医院病理科1993～1998年外科手术及肠镜活检的部分标本，腺瘤40例，腺癌80例；15例正常粘膜取自距肿瘤边缘5 cm以上的切缘，标本均用10%福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，分别作HE及免疫组化染色。HE切片按1981年《全国大肠癌病理协作研究统一规范》复诊。所有患者术前均未作放疗、化疗及免疫治疗。
1.2 免疫组化试剂及方法 鼠抗人p53(DO7)、PCNA(Pc10)单克隆抗体及S-P免疫组化试剂盒为美国Zymed公司产品，购自福建迈新公司，按试剂盒说明书操作，每组均设阳性和阴性对照。
1.3 免疫组化及细胞核形态定量测定 采用上海交大JD-IAS分析系统，对免疫组化进行定量测量，每例随机选择100个肿瘤细胞，测定p53、PCNA蛋白表达的平均光密度(Mean optical density,MOD)，用光密度值表示p53及PCNA相对含量。另对HE切片作细胞核形态计量测定，包括核面积(An)、核周长(Pn)、核平均直径(Dn)。
1.4 统计学处理 应用计算机分析，统计各组数据用
±s表达行F检验，每组资料比较用q检验，两者相关性用Sperman相关分析。
2 结果
2.1 大肠腺瘤及腺癌中核形态参数及p53、PCNA免疫组化定量比较 正常粘膜核面积、核周长、核平均直径与腺瘤及腺癌相比差异有显著性(P＜0.05，P＜0.01)，腺瘤及腺癌间核面积及核平均直径差异有显著性(P＜0.05)。腺癌组p53及PCNA蛋白含量高于腺瘤及正常粘膜组，PCNA含量与腺瘤的组织类型无关而与腺癌的组织分化有关(P＜0.05)，用Spearman相关分析p53及PCNA相对含量与核面积及核平均直径呈正相关(P＜0.01)，见表1。
表1 大肠腺瘤及腺癌中核形态参数及p53、PCNA免疫组化质量比较
| 组别 |
n |
核面积(μm2) |
核周长(μm) |
核平均直径(μm) |
p53 MOD值 |
PCNA MOD值 |
| 正常粘膜 |
15 |
71.42±11.53 |
33.94±2.31 |
10.80±1.01 |
|
0.34±0.13 |
| 腺瘤 |
40 |
98.73±24.62**△△ |
40.70±6.91△△ |
13.77±3.78**△△ |
0.18±0.09△△ |
0.50±0.16△ |
| 管状 |
12 |
80.22±12.01 |
39.69±4.41 |
12.64±1.54 |
0.16±0.05 |
0.47±0.12 |
| 绒毛管状 |
14 |
89.59±19.83 |
37.62±5.74 |
11.9±2.26 |
0.19±0.08 |
0.49±0.14 |
| 绒毛状 |
14 |
107.56±29.47 |
44.65±8.45 |
17.21±4.51 |
0.20±0.12 |
0.52±0.15 |
| 腺癌 |
80 |
115.28±30.60△△ |
47.55±10.03△△ |
15.31±5.52△△ |
0.61±0.23▲△△ |
0.72±0.24△△ |
| 高分化 |
38 |
112.01±27.91 |
43.75±8.77 |
13.90±4.40 |
0.58±0.15 |
0.64±0.17 |
| 中分化 |
18 |
119.34±31.54 |
47.67±11.63 |
15.80±5.19 |
0.63±0.19 |
0.73±0.20☆ |
| 低分化 |
24 |
118.63±36.39 |
53.49±10.42 |
17.03±5.06 |
0.64±0.22 |
0.80±0.19 |
与腺癌相比：**P＜0.01；与腺瘤相比：▲P＜0.05；与正常组相比：△P＜0.05，△△P＜0.01；与高分化腺癌相比：☆P＜0.05
3 讨论
细胞形态是判断肿瘤及分化程度的主要依据，特别是细胞核的变化；与病理学特征及生物学行为密切相关〔1〕，本文应用图像分析及免疫组化方法检测大肠腺瘤-癌序列中细胞核形态参数及p53、PCNA蛋白含量的变化，结果显示：正常粘膜-腺瘤-腺癌过程中，细胞核面积、核周长、核平均直径均逐渐增高，并且腺瘤及腺癌组均明显高于正常组。说明核形态变化是判定细胞异型的重要依据，当细胞DNA含量达到一定程度时，细胞发生恶变，DNA异倍体细胞增多，这与组织病理学观察结果是一致的。
p53是大肠癌发生中最常变化的基因〔2〕，与细胞周期负调控有关。PCNA是DNA聚合酶delta的辅助蛋白，其表达与细胞增殖有关，应用单克隆抗体检测大肠肿瘤中p53、PCNA表达已有不少报道，但多采用阳性细胞数判断结果，而忽视染色强弱，此方法因易受人为因素影响，不能充分反映p53、PCNA量的变化，本实验应用图像分析系统检测大肠肿瘤p53和PCNA量的变化，结果表明，正常粘膜未见p53表达，腺癌组p53及PCNA表达的相对含量均高于腺瘤组。其原因可能是腺瘤组阳性细胞少，相对含量低，细胞增殖活性低，不足以维持细胞的恶性表型；腺癌中p53及PCNA含量高，p53基因突变的细胞数目多，细胞的克隆增殖旺盛，足以维持细胞的恶性表型。在不同类型的大肠癌中p53表达量差异无显著性；可能与多因素共同参与组织分化有关，PCNA含量在差分化腺癌组明显高于高分化腺癌组，说明细胞分化越差，细胞增殖活性越高，细胞浸润和转移的机会增多，预后较差〔4〕。
在大肠腺瘤-癌序列中，随着细胞异型性增加，DNA合成增多，细胞核面积、核周长、及核平均直径均明显增大，p53及PCNA表达含量亦增加，应用统计学分析，两者呈正相关，说明细胞异型越大，细胞增殖活性越强，p53基因突变率越高，因而容易恶变。因此检测大肠肿瘤中p53、PCNA相对含量及细胞核形态参数有助于预测腺瘤生物学行为发展趋势及大肠癌早期诊断和预后诊断。
作者简介：陈金璋，男，42岁，主治医师
参考文献
1，Hedley DW. Flow cytometry using paraffin-embedded tissue five years on cytometry. Hum Pathol, 1989;10(3):229
2，Baker SJ, Preisinger AC, Jessup JM et al. p53 gene mutation occur in combination with 17 pallelic deletions as late event in colorectal tumorigenesis. Cancer Res,1990;50(23):7 717～7 729
3，Bravo R, Frank R, Blundell P et al. Cyclin/PCNA is the auxiliary protein of DNA polymerase delta. Nature,1987;326(4):515
4，Suehiro T, Matsumata T, Ituskaea H et al. Clinicopathologic features and prognosis of resected hepatocellular carcinomas of varied size with special reference to proliferating cell antigen. Caneer,1995;76(3):399～405
2000-04-08收稿，2000-06-17修回
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