p53基因增强非小细胞肺癌细胞对顺铂化学敏感性的研究

中华结核和呼吸感染 1999年第6期第22卷 论著摘要

作者：温桂兰　张晓春　范希光　饶纬华

单位：330006 南昌，江西医学院第二附属医院分子医学中心及呼吸科

　　我们以具有抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的p53基因加入肺癌细胞培养板上，观察它对DNA损伤药顺铂(cisplatin,CDDP)抑癌作用的影响，从分子水平上为提高肺癌疗效拓展新的途径。

　　材料与方法

　　(1)材料：非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系LTEP-a-2购自中国科学院上海细胞生物研究所。表达型p53质粒：由美国华盛顿大学吴瑛博士赠送。SA阳离子脂质体：购自中国科学院上海生物化学研究所。CDDP：锦州制药厂产，批号961201-4。⑵基因转染：收获对数生长期的LTEP-a-2细胞，继续培养24小时，取所需量的p53cDNA质粒，以每μg质粒50μl的不含小牛血清的RPMI 1640培养基稀释，SA脂质体以每10 μg 50μl的不含小牛血清的RPMI1640培养基稀释，以质粒∶SA脂质体1∶10的比例混合^［1］，室温静置15分钟，加入到上述细胞中。(3)细胞抑制实验：当LTEP-a-2细胞生长达80％汇合时收获细胞，以每孔8×10⁴细胞接种于96孔培养板。共接种4板，分别于转基因后第2、4、6、8日(加CDDP后1、3、5、7日)，每板分别以以下9组进行实验：①空白对照组。②p53质粒2μg+SA 20 μg。③p53质粒4 μg+SA 40 μg。④CDDP 10 μg/ml。⑤CDDP 50 μg/ml。⑥p53质粒2μg+SA 20 μg+CDDP 10 μg/ml。⑦p53质粒2 μg+SA 20 μg+CDDP 50 μg/ml。⑧p53质粒4μg+SA 40 μg+CDDP 10 μg/ml。⑨p53质粒4 μg+SA 40 μg+CDDP 50 μg/ml。每组设重复孔3孔，细胞种板后继续培养24小时，按上述方法和剂量转染p53基因，转染18小时后去转染液，按上述剂量加入CDDP。(4)细胞活力测定：采用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法。分别在加入CDDP后1、3、5、7日时每孔加入MTT10 μl(5 mg/ml)，细胞在37℃培养箱继续培养4小时，每孔加入200 g/L十二烷基磺酸钠＋50％二甲基甲酰胺溶液150 μl，培养过夜。在酶标仪上以570 nm为吸收波长、690 nm为参比波长比色，测量每孔吸光度［A，曾称光密度(OD)］值。(5)统计方法：采用方差分析q检验比较对照组与各实验组的差别。

　　结果

　　(1)在转染p53基因2 μg及4μg+SA后第2、4、6、8日，与同日对照组比较，A值均有明显差异，其中4μg组差异更为显著(P＜0.01)。(2)CDDP组：CDDP 10 μg组与同日对照组比较，在转染基因后第2、4、6、8日A值显著降低(P＜0.01)；CDDP50 μg组与同日对照组比较，在转染基因后第2、4、6、8日A值也均显著减小(P＜0.01)。表明CDDP10 μg/ml以上的浓度能显著抑制LTEP-α-2的增殖。(3)SA阳离子脂质体介导p53基因转染到LTEP-α-2细胞后第2、4、6、8日，p532 μg+SA 20 μg+CDDP 10 μg/ml组及p53 4 μg+SA 40 μg+CDDP 10 μg/ml组与同日CDDP10 μg组比较A值均显著降低(P＜0.05～0.01),表明在加用CDDP之前转染p53基因，能增强CDDP抑制LTEP-α-2细胞增殖的作用。(4)SA阳离子脂质体介导p53基因转染到LTEP-α-2细胞后第2、4、6、8日，p532 μg+SA 20 μg+CDDP 50 μg/ml组及p53 4 μg+SA 40 μg+CDDP 50 μg/ml组与同日CDDP50 μg组比较A值均近似，两组细胞均近完全抑制。

　　讨论

　　肺癌细胞对化疗的耐受性，从分子水平可归纳为两方面原因，一是有些基因及其表达产物可抑制化学药物进入肿瘤细胞，使细胞内药物浓度很低，不能使肿瘤细胞坏死，如耐多药基因1(MDR-1)；另一是有些基因及其表达产物可抑制细胞凋亡过程，从而削弱化疗抑癌作用，如HSP60、Bcl-2等基因。

　　p53基因是与人类恶性肿瘤相关性最高的肿瘤抑制基因，约60％NSCLC和80％小细胞肺癌(SCLC)可检测到p53基因的突变。p53基因编码的P53蛋白具有转录因子特性，在细胞周期的调控中，可抑制细胞从G₁期进入S期，从而抑制其分化和增殖，还有促进细胞凋亡的作用。本研究中应用SA阳离子脂质体介导的野生型p53基因转染到NSCLC细胞系有p53基因突变的LTEP-α-2细胞培养板上，有明显的抑制细胞增殖作用，在加用较小剂量的CDDP后，该肿瘤细胞增殖更显著地受到抑制，表明p53基因在人NSCLC细胞中的表达对CDDP的化学敏感性有显著的促进作用。至于p53为何可增强CDDP的作用，其机制还不很清楚，文献报道可能与下列基因及其表达产物有关：上调WAF1基因表达P21蛋白，而诱发细胞调亡；调节Bax基因，下调Bcl-2基因表达，缓解Bcl-2介导的抑制细胞凋亡作用；介导C-myc基因表达，诱导细胞凋亡等。总之p53基因加用CDDP可促进细胞凋亡，可能是其基本的作用机制。我们观察到单用大剂量CDDP与p53基因加大剂量CDDP的抑癌作用无明显差异，是因为大剂量CDDP已能使肿瘤细胞处于几近完全的抑制状态，但临床上大剂量CDDP引起的显著毒副作用，常常是患者所不能接受而必须立刻中断治疗的。

　　参考文献：

　　1　杨静平，孔玉英，林其谁.SA脂质体－高效介导DNA转染的新试剂.生物化学与生物物理学报，1993，25：231-237.

　　收稿：1998-08-21　　修回：1998-12-30