鼻咽癌肿瘤c-myc基因表达及p16基因失活的研究
中华耳鼻咽喉科杂志 2000年第6期第35卷 临床研究
作者：郑珺 李文生 黄若葵 李申德 朱章菱
单位：郑珺 李文生 黄若葵(韶关市粤北人民医院耳鼻咽喉科 广东省 512026)；李申德(中国医学科学院肿瘤研究所)；朱章菱(首都医科大学附属北京红十字朝阳医院基础医学研究中心)
关键词：鼻咽肿瘤；基因；myc；基因；p16；失活
【摘要】 目的 以原发性鼻咽癌为研究对象，探讨p16抑癌基因，myc家族癌基因在鼻咽癌发生、发展及其生物学行为的变化规律。方法 用多重聚合酶链反应(multiple polymerase chain reaction, MPCR)、限制性内切酶PCR、免疫组化及逆转录PCR(reverse transcriptase PCR, RT PCR)方法，检测69例鼻咽癌活检肿瘤组织中，P16基因纯合缺失、甲基化、p16基因蛋白表达(免疫组化)、c-myc基因表达等情况。结果 P16基因纯合缺失7例，甲基化11例，总失活率为26.1%(18/69)。免疫组化检测p16基因蛋白表达阴性60.9%(42/69)；阳性39.1%(27/69)。RT PCR，myc基因检测表达结果73.9%(51/69)，无表达者26.1% (18/69)。结论 研究表明鼻咽癌发生与p16抑癌基因失活、癌基因激活有着密切关系。
Studies on c-myc gene expression and p16 gene inactivation in nasopharyngeal carcinoma
ZHENG Jun, LI Wensheng, HUANG Ruokui, et al.
(Department of Head and Neck Surgery，Tumor Hospital of Guangzhou, Guangzhou 510095, China)
【Abstract】 Objective The alterations of c-myc and p16 genes and their relationship with the development and progression of nasopharyngeal carcinoma were studied. Methods Sixty-nine biopsies of nasopharyngeal carcinoma were examined for the homozygous deletion methylation and reduced expression of p16, and the overexpression of myc family oncogenes using multiple PCR, restriction endonuclease coupled PCR, reverse transcriptase PCR and immunohistochemistry. Results The homozygous deletion and methylation of p16 gene were found in 7 and 11 cases respectively. The total inactivation rate was 26.1% (18/69). The negative expression of p16, as shown by immunohistochemical examination was found in 42 out of 69 cases (60.9%). The overexpression of myc family oncogenes was found in 51 cases (73.9%). Conclusion It suggests that the inactivation of anti-oncogene p16 and the activation of myc family oncogene may play an important role in the development of nasopharyngeal carcinoma.
【Key words】 Nasopharyngeal neoplasms; Genes, myc; Genes, p16; Inactivated
肿瘤的发生是多种因素共同作用的结果，其中部分肿瘤是由于原癌基因的激活和/或抑癌基因失活而发生的。随着分子生物学技术的发展，癌基因和抑癌基因与多种肿瘤相关性的研究日益增多。本研究以鼻咽癌肿瘤活检组织为研究样本，采用多重聚合酶链反应(multiple polymerase chain reaction, MPCR）、限制性内切酶PCR、逆转录PCR(reverse transcriptase PCR, RT PCR)等方法，研究p16抑癌基因失活情况，癌基因表达，探讨鼻咽癌发生、发展及其生物学行为与上述两类基因的关系，试图建立基因诊断新方法，为临床诊断，预后判断、指导治疗提供科学依据。
材料与方法
一、材料
1．样本：取自1995年1月～1997年1月广东省粤北人民医院耳鼻咽喉科患者，经病理证实为鼻咽癌69例，其中13例复发后取材。患者男45例,女24例，年龄最小21岁，最大69岁。免疫组化方法的喉癌对照组69例由天津耳鼻咽喉科研究所提供，活检标本取后-80℃保存。
2．试剂：引物：myc基因通用引物序列： 上游 5′-CCC AGC GAG GAC ATC TGG AAG AA-3′， 下游 5′-GAG AAG CCG CTC CAC ATG CAG TC-3′。
β2-MG珠蛋白引物序列（对照）： 上游 5′-ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA-3′， 下游 5′-ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG-3′， 由中国医科院肿瘤研究所遗传室李申德教授提供。
p16基因引物序列： 外显子1 5′-GAA GAA AGA GGA GGG GCT G-3′， 5′-GCG CTA CCT GAT TCC AAT TC-3′， 外显子2 5′-GGA AAT TGG AAA CTG GAA GC-3′， 5′-TCA TCA GTC CTC ACC TGA G-3′， 根据文献［1］设计，中科院微生物所合成。
内对照引物(β-珠蛋白)： 5′-GGT AAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAG ACA GGT ACG GCT CTC ATC-3′， 5′-CCC TTC CTA TGA CAT GAA C-3′，由美国赛百盛公司合成。
其他试剂：Taq耐热聚合酶、dNTP、蛋白酶K、Smal内切酶等均购自北京通康公司。免疫组化p16蛋白试剂盒：由美国Maxin公司生产，购自福州迈新生物公司。RT PCR盒：购自北京鼎国生物公司。其他试剂：由北京红十字朝阳医院基础医学研究中心提供。
3.仪器：PE-480扩增仪、低温离心机、UVP凝胶成像仪等均由北京红十字朝阳医院提供使用。
二、方法
1．免疫组织化学方法：活检组织经石蜡包埋后，连续切片4 μm厚，常规脱蜡、水化、3% H2O2室温20 min、蒸馏水洗3次，TBS洗3次，用羊血清封闭15 min(1∶20)，然后P16工作液4℃过夜，次日TBS洗3次，a Rb IgG/Bio 1:200室温1 h，TBS再洗3次，DAB镜下控染，自来水充分冲洗；苏木素复染、分化、透明、封固。结果判定：观察10个高倍视野1 000个肿瘤细胞，RC细胞核出现棕黄色颗粒或均匀棕黄色为阳性，记录方式：(-)无明显阳性细胞；(+)阳性细胞＜40%；(++)阳性细胞数＞40%［2］ （图1，2）。
2．p16基因失活的检测： 纯合缺失检测采用常规方法提取组织DNA，首先将肿瘤标本(新鲜)约100 mg置于500 μL 赖胺酸缓冲裂解液中，充分捣碎后加蛋白酶K 500 μg/ml，室温放置24 h，然后酚、氯仿、氯仿/异戊醇(24∶1)抽提，无水乙醇沉淀DNA，-20℃过夜，次日用80%乙醇清洗1次，干燥，加TE液80 μL。RNase酶1 μL (10 mg/ml) 37℃水浴30 min后，冷却，4℃溶解24～48 h，扩增用或-20℃冰箱冻存待用。用PCR方法扩增p16基因第一外显子和第二外显子及内对照引物的多重PCR扩增。反应体积20 μL：模板DNA 1 μL、10×buffer液2 μL、dNTP(2.5 mmol/L)2 μL、DMSD 1 μL、外显子1引物2 μL，如外显子2及内对照引物各1 μL。然后补足水于20 μL。PCR扩增条件：94℃变性5 min，72℃加入Taq耐热聚合酶1单位，进入循环，循环参数为94℃变性1 min、60℃退火1 min、72℃延伸1 min，35个循环后72℃再延伸5 min。琼脂糖凝胶电泳：取10 μL扩增产物，2 μL电泳buffer液，混匀后点于2%琼脂糖凝胶孔中，电压100 V，时间20～25 min后，EB染色，在紫外UVP凝胶成像仪下分析结果(图3,4)。
甲基化检测采用对未发现纯合缺失标本进行p16基因异常甲基化检测。取肿瘤组织DNA 1 μg(约3 μL)，用甲基化敏感限制性内切酶Sma1消化25℃过夜。总体液量10 μL，用上述方法分别扩增p16基因外显子1和内对照，如果经Sma1消化的DNA仍能扩增出外显子1则判断为甲基化, 即该基因外显子1的5′端上游出现异常甲基化(图5)。内对照引物序列不含有内切酶位点，所以不能被SmaI消化，每份标本必有内对照带扩出。
图3 p16基因外显子1纯合缺失。泳道1：DNA分子量标志X174/Hae Ⅲ；泳道2：p16外显子1阳性标准；泳道3～10：肿瘤组织标本，其中泳道4为p16外显子1纯合缺失
图4 p16基因外显子2纯合缺失。M：核酸分子量标志pBR322/MSP I；泳道1：内对照和p16外显子2阳性标准；泳道2：第二外显子缺失(只扩增出755 bp β-珠蛋白片段)泳道3、4、5、6、7 第二外显子无缺失(二条带均扩出)
图5 p16基因外显子1甲基化。泳道1、2、3、4 为内对照(755 bp β-珠蛋白片段)；泳道5、7 扩出336 bp示第一外显子甲基化；M：核酸分子量标记pBR322/MSP I
3．RT PCR检测myc基因的表达：为达到科研严谨性，扩增癌基因myc基因时，同时加入β-MG珠蛋白基因为内参照。
RNA提取：取米粒大小活检组织-80℃保存，放入0.5 ml离心管内，加50 μL RNA裂解液后捣碎组织，混匀再加150 μL裂解液充分震荡溶解，离心12 000 r/min(4℃)15 min。移上层液相于另一新0.5 ml离心管内，再加3倍体积无水乙醇，-20℃冰内停置30 min或-30℃过夜，当日/次日(4℃)离心12 000 r/min 10 min，弃去上清，80%乙醇清洗1次，离心(4℃) 12 000 r/min 10 min，弃上清，干燥后加水(工作水)10 μL，溶解RNA。
RT反应扩增（逆反转录PCR，RNA-cDNA）：①取3～5 μL RNA、dNTP 2 μL (2.5 mmol/L)、AMV酶2 U(8U/ μL)、AMV缓冲液2 μL，随机引物（RP 1 μL)、RNasin 1 μL(6 U/ μL)补水至10 μL；②放置室温10 min，42℃水浴30 min，95℃ 5 min，迅速放置 -20℃冻存或PCR扩增用。
RTPCR扩增：①反应体系25 μL：取3～5 μL上述反应产物，dNTP 2 μL、10×buffer 2.5 μL，myc基因通用引物各20 pmol/L(各1 μL),内对照引物β2-MG引物各1 μL(20 pmol/L),补水至25 μL体积；②扩增条件：94℃变性10 min，冷却加Taq耐热聚合酶1 U，适量石蜡油，然后94℃60 s，50℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30个循环后，72℃延伸7 min；③电泳：取PCR产物10 μL，2 μL电泳buffer混匀点于2%琼脂糖凝胶孔中，100 V电压20～30 min，UVP成像仪观察结果(图6)。
图6 RT PCR myc基因扩增表达。泳道1为内对照(β2-MG 128 bp片段)；泳道2、4、5 β2-MG对照片段及c-myc扩增带；37、38号病例有过表达现象(268 bp扩增带增宽)；M：核酸分子量标记pBR322/MSP I
4.统计学处理用χ2检验。
5．随访69例，获访到54例，经病理确诊后行放射治疗，随访病程5～5.5年，死亡27例，其中25例均死于肿瘤远处转移（脑转移11例，肺转移8例，肝转移6例）。
结果
一、p16抑癌基因失活
1．免疫组化检测P16蛋白表达结果见表1，2。
表1 两种头颈部肿瘤中P16蛋白的表达
| 肿瘤分类 |
总例数 |
阳性例数(%) |
阴性例数(%) |
| 鼻咽癌 |
69 |
27（39.1） |
42（60.9） |
| 喉癌 |
69 |
40（58.0） |
29（42.0） |
表2 P16蛋白表达与鼻咽癌临床分期的关系(例数)
| 临床分期 |
例数 |
P16阳性 |
P16阴性 |
| I、II期 |
11 |
9 |
2 |
| III、IV期 |
58 |
18 |
40 |
由表1可见，鼻咽癌P16蛋白阴性表达高于阳性表达，鼻咽癌阴性表达高于喉癌的阴性表达，差异有显著性（P＜0.025）。
由表2可见，鼻咽癌Ⅲ、Ⅳ期P16蛋白阴性表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期，差异有显著性（P＜0.01）。
2．p16基因纯合缺失结果：69例新鲜活检组织标本第一外显子缺失6例，第二外显子缺失1例，共计7例（10.1%)。
3．p16基因异常甲基化检测结果：62例无基因缺失者检测异常甲基化有11例，甲基化率为17.7% (11/62);占总数15.9%(11/69)；p16基因总失活率为26.1%(18/69)。
二、家族癌myc基因表达检测结果
检测69例鼻咽癌活检组织myc基因，经RT PCR检测，有表达者51例(73.9%)，表达阴性者18例(26.1%)。电泳观察结果：myc基因中c-myc扩增出片段为268 bp，L-myc 227 bp。有些图形扩增带268 bp较宽，可能包括N-myc基因(230 bp)。RT PCR检测L-myc基因，部分病例有过表达现象（如图6中37，38号病例）。
三、3项检测与随访结果的关系(表3)
本研究随访时间是5～5.5年，69例中获访者54例，获访率为78.3%（54/69)，其中死亡27例（占总数的39.1%)。
表3 3项检测与随访结果的关系
| 获访者 |
p16基因失活 |
p16基因蛋白表达 |
myc癌基因表达 |
| 缺失 |
甲基化 |
+ |
- |
过表达 |
+ |
- |
| 存活 |
3 |
2 |
14 |
13 |
0 |
18 |
9 |
| 死亡 |
2 |
8 |
5 |
22 |
25 |
2 |
0 |
注：*经χ2检验，死亡组与存活组比较差异有显著性，P＜0.05；3项指标综合比较差异有非常显著性，P＜0.001
讨论
一、p16抑癌基因与鼻咽癌的关系
1．p16抑癌基因失活（缺失、甲基化）与鼻咽癌的关系： p16抑癌基因又称为多种肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor I, MTS1)，1994年由Kamb等［1］克隆成功。P16蛋白直接抑制细胞周期依赖性激酶4，可阻断细胞周期进程而抑制癌细胞成长，保持活化状态。当p16基因失活情况，引起G1期缩短，细胞周期加速，特别是DNA在没有修复前过早进入S期，这可能是细胞恶化的关键［3］。p16基因失活途径以纯合缺失及甲基化为主，而点突变极少见。本研究69例鼻咽癌活检组织中有7例p16基因缺失，11例异常甲基化，失活率26.1%。由于p16基因缺失，抑癌基因功能丧失，即抑制癌细胞生长功能丧失，肿瘤有可能发生。这与中国人群鼻咽癌p16基因失活率为25%的文献报道基本相近［4］。在本研究结果中，鼻咽癌存活者与死亡者外显子缺失比较差异无显著性。p16基因另一失活途径是异常甲基化，本研究中甲基化在死亡者中明显高于存活者，差异有显著性。其原因是异常甲基化出现造成转录功能丧失，因为p16基因5′端上游促进子与外显子1区域富含胞嘧啶和鸟嘌呤［5，6］，这些胞嘧啶被甲基化后，抑制基因转录功能丧失致使肿瘤发生，且使机体对肿瘤反应差，预后差，死亡率高。通过p16基因失活检测，对指导治疗和检测微量改变是有重要意义，也可用于治疗后复发的检测。
2．p16基因蛋白表达与鼻咽癌的关系：免疫组化法是p16基因蛋白活性变化又一观察指标。在免疫组化中，p16基因蛋白阳性表达还是阴性的表达与肿瘤发生有一定相关性。当p16蛋白表达阳性率下降，表明抑制癌细胞生长能力降低。本研究中69例中阴性表达者42例，阳性者27例，与69例喉癌对照组比较(阳性40例，阴性29例) 差异有显著性，说明鼻咽癌阴性表达高于喉癌，高于文献报道［7，8］，也说明P16基因失活在鼻咽癌发病中所起的作用可能比在喉癌中更重要。
此外，临床分期Ⅲ、Ⅳ期中p16基因蛋白表达阴性高于Ⅰ、Ⅱ期，差异有显著性。免疫组化证实，p16基因蛋白表达阴性的高低与临床分期有一定关系，同时从随访结果分析，54例中有22例死亡者表达阴性，进一步证实，阴性表达与临床预后也有一定相关性。因此，本研究这一变化规律对临床治疗、预后追踪有指导意义。免疫组化方法对检测p16基因蛋白表达方法简便、易行。在进行临床病理诊断同时可以一起检测。
二、鼻咽癌与c-myc癌基因关系
myc癌基因家族有3个成员，c-myc，N-myc和L-myc。其中c-myc是myc家族中最重要一员，其编码产物c-myc蛋白质核蛋白类，基因结构具有独特性，可作为转录因子在细胞周期、细胞增殖，分化凋亡，肿瘤发生转移等生理病理过程中发挥重要作用。myc基因属于“不死性”或“永生性”癌基因［9］，与SV40大T抗原一样，可使体外培养的原代细胞持续传代而不出现肿瘤表型，其过度表达可改变细胞内的基因调控，使细胞易于转化为恶性表型，当与其他癌基因活化或抑癌基因的失活协同作用时可加速或启动肿瘤发生。c-myc在肿瘤形成中激活方式主要是基因扩增和过度表达。本研究中69例标本有51例基因扩增阳性占受检人数的73.9%，其中25例过表达；无表达者18例，占26.1%；说明c-myc癌基因调控受到干扰，可能与肿瘤发生有一定关系。25例过表达者，在随访患者死亡组内，均死于肿瘤远处转移，再次证实c-myc基因的激活、过表达、转化恶性型表型致使鼻咽癌患者病程恶化转移而死亡。可见鼻咽癌发生与c-myc基因激活有密切关系。
图1 鼻咽癌组织p16基因蛋白表达阳性。RC细胞核有棕黄色颗粒或均匀棕黄色。免疫组化×200
图2 鼻咽癌组织p16基因蛋白表达阴性。RC细胞核无棕黄色颗粒或均匀棕黄色。免疫组化×200
资助项目：广东省医学科学技术研究课题；省卫生厅科研立项资助（A1997407）
参考文献
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（收稿日期：2000-02-16）
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