鼻咽癌颈淋巴结转移EB病毒基因的检测

中华实验和临床病毒学杂志 1999年第4期第13卷 论著

作者：李俊　李群　李瑞珠

单位：李俊　230022　合肥，安徽医科大学附属医院肿瘤科；李群、李瑞珠　安徽医科大学微生物教研究室

　　关键词： 鼻咽肿瘤；聚合酶链反应；细胞诊断学

　　【摘要】　目的　观察鼻咽癌(NPC)颈淋巴结转移EB病毒基因情况。方法　采用细针穿刺结合聚合酶链反应(PCR)技术对50例颈部肿块穿刺液进行EBV DNA检测。结果　30例鼻咽癌颈淋巴结转移者EBV DNA阳性数27例，阳性率为90.0%。7例恶性淋巴瘤者EBV DNA阳性数1例，阳性率14.3%。8例非NPC颈部转移癌者EBV DNA阳性数1例，阳性率为12.5%。5例鼻咽部炎症伴颈淋巴结增生者均未检测到EBV DNA。结论　细针穿刺结合PCR方法快速灵敏，所取标本量少，特异性高，尤其对于临床难以确认的隐匿性鼻咽癌及原发灶不明的颈部转移癌，具有一定的临床诊断价值，值得推广应用。

Detection of Epstein-Barr virus gene in nasopharyngeal carcinoma with neck lymphatic metastasis　

LI Jun, LI Qun, LI Ruizhu.

　　Department of Oncology, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022,China

　　【Abstract】　Objective　To investigate the presence of Epstein-Barr virus(EBV) gene in neck lymphatic metastasis of nasopharyngeal carcinoma.Methods Fifty patients′ masses in the neck were punctured and the fluids were analyzed with PCR for EBV DNA.Results Twenty seven cases showed EBV DNA positive among thirty cases of nasopharyngeal carcinoma with neck lymphatic metastasis, and the positive rate was 90%. One case was EBV DNA positive in seven cases of malignant lymphoma and the positive rate was 14.3% .One case was EBV DNA positive in eight tumor patients without NPC metastasis and the positive rate was 12.5%. Five cases with nasopharyngeal inflammation and neck lymphatic node proliferation were demonstrated to be EBV DNA negative.Conclusion This technique is rapid, sensitive and specific, which is valuable clinically, especially for the diagnosis in patients with cryptic nasopharyngeal carcinoma and with neck metastasis but lack of clear original focus.

　　【Key words】　Nasopharyngeal neoplasrns　　Polymerase chain reaction　　Cytodiagnosis

　　众所周知，鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma NPC)与EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)感染关系密切^［1，2］。许多研究表明NPC患者鼻咽部可检测到EBV DNA^［3］，NPC颈淋巴结转移发生率高达60.30%～86.10%^［4］，但有关NPC颈淋巴结转移中EBV DNA存在状况及表达研究国内报道极少。为此，我们对50例临床拟诊NPC颈淋巴结转移的病人，采用细针穿刺结合聚合酶链反应(PCR)技术进行EBV DNA检测。现将结果报告如下。

　　1　材料和方法

　　1.1　一般资料　50例NPC中男性38例，女性12例，年龄14～79岁，肿块直径0.3～8 cm，多个不等。发生部位主要在下颌角和上颈部。左侧22例，右侧17例，双侧11例。50例均以颈部肿块为就诊原因。病程1月～2年左右，50例均有病理证实。随访3个月以上。

　　1.2　细胞学方法　坐位，确定肿块部位、大小。皮肤常规消毒，取干燥10 ml注射器接7号针头，左手固定肿块，右手持注射器将针头经皮肤刺入肿块，负压抽吸。针尖在肿块不同方向来回数次，幅度要小，放掉负压，退出针，将吸出物涂片2张，分别做瑞氏和HE染色，镜检。另将针头内剩余微量内容物注入无菌塑料离心管中，进行PCR检测。

　　1.3　PCR检测　将针吸物悬浮于1 ml生理盐水中，经12 000 r/min离心5 min弃上清液，加入50 μl裂解液后，55℃保温30 min(每10 min轻轻振荡消化管)，然后100℃煮沸10 min。经14 000 r/min离心5 r/min，吸取上清液2 μl做PCR反应模板样本。吸取PCR反应混合物26 μl于PCR反应管中离心数秒。滴加两滴液体石蜡，加入样本2 μl标本。振荡混匀离心数秒。在PCR仪上按94℃300 s、94℃45 s、55℃45 s、72℃45 s步骤，后三步重复循环35次。最后一次循环72℃延伸至300 s。扩增产物经凝胶电泳，紫外线灯下观察结果。被溴化乙绽染色的DNA显现明亮的红橙色的荧光，标本在阳性对照同一水平位置上出现红橙色荧光带即为阳性，否则为阴性。扩增靶序列选自EBV基因组核抗原1区，扩增片段为269 bp。

　　2　结果

　　2.1　50例细针吸取颈淋巴结穿刺液检测　用PCR技术检测EBV DNA结果见表1。经卡方检验，鼻咽癌患者与恶性淋巴瘤和其它部位来源肿瘤患者以及鼻咽部炎症患者之间的阳性率差异有显著性。

　　2.2　30例NPC患者颈淋巴结的细胞学检查　一次诊断颈淋巴结转移癌者25例，与病理符合率为83.3%(25/30)，而PCR检测与病理符合率为90.0%(27/30)。2例细胞学诊断为淋巴结高度反应性增生的标本，经PCR检测为EBV DNA阳性。提示有些细胞学检查不能明确鼻咽癌伴颈部淋巴结转移患者是否为转移癌时，PCR法有助于提高检测率，辅助临床鉴别诊断。两种诊断技术结果的比较如表2。

　　3　讨论

　　PCR扩增技术是由美国科学家Kary Mullis 1985年发明的，国内90年代开始使用。本研究采用PCR技术，利用EBNA-1区特异性靶序列为引物在体外扩增，检测50例患者颈部淋巴结穿液中的EB病毒基因。其中30例经病理证实为NPC患者的标本，27例EBV DNA检测阳性(阳性率90.0%)，与国外学者Feinmesser等^［5］报道的阳性率为84.6%(11/13例)结果相近。头颈部其它部位恶性肿瘤患者的标本阳性率分别为14.3%和12.5%。5例鼻咽部炎症改变患者标本中均末检出EBV DNA。因此，PCR是一种很敏感诊断技术，对于NPC及其它恶性肿瘤颈部转移性淋巴结中EBV DNA检测已达到预期临床诊断价值。

　　鼻咽癌颈淋巴结转移发生率很高。常发生在耳鼻咽喉症状出现之前^［6］。本文30例NPC均以颈淋巴结转移为首诊的。颈部淋巴结有无转移对NPC进行分期、制定治疗方案及预后有重要意义。采用针吸细胞学虽可以很快确定肿块性质，但当细胞学涂片上癌细胞较少且分化较差时，则细胞学诊断较困难。本文有5例细胞学未诊断就是上述原因。PCR法从5例假阴性中检出2例阳性。另3例阴性可能与针吸细胞学未采集到癌细胞，或与NPC本身性质有关^［7］。

表1　50例颈部淋巴结穿刺液PCR检测结果

　　Tab.1　Detection results of neck lymphatic node fluids in 50 cases by PCR

表2　30例鼻咽癌颈淋巴结穿刺液细胞学检查与PCR检测结果比较

　　Tab.2　Cytology and PCR detection results of neck lymphatic node fluids from 30 NPC cases

　　对临床上拟诊鼻咽癌颈淋巴结转移的可疑标本做PCR检测的EBV DNA， 使病人在一次取材时，既做细胞病理诊断，又做EBV基因检测。这样，细针吸取微量标本比淋巴结活检时对病人的创伤要小，且不影响局部放疗和放疗后随访。具有省时、快速、安全、无痛苦可重复检查、所取标本量少、特异性高等优点。所以该方法对临床上难以确认的隐匿性鼻咽癌及原发灶不明的颈部转移癌患者可做为常规检测，以提高NPC早期诊断水平。值得临床推广应用。参考文献

　　1　Ho JH. An epidemiological and clinical study of nasopharyngeal carcinoma. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1978,4:182-198.

　　2　区宝祥，曾毅，主编.鼻咽癌病因和发病学的研究.北京：人民卫生出版社，1985.12-13.

　　3　Cai WM, Li YW, Wu B, et al. Serologic diagnosis of nasopharyngeal carcinoma. A double-blind study of four EB virus antibodies with evaluation by sequential discrimination. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1983,9:1763-1768.

　　4　李振权，潘启超，陈剑经，主编.鼻咽癌临床实验研究.广州：广东科技出版社，1983.202-206.

　　5　Feinmesser R, Miyagaki I, Cheung R, et al. Diagnosis of nasopharyngeal carcinoma by DNA amplification of tissue obtained by fine-needle aspiration. N Engl J Med, 1992,326:17-21.

　　6　汤钊猷，主编.现代肿瘤学.上海：上海医科大学出版社，1993.590-592.

　　7　刘孟忠，梁伊仁，毛志达，等.EB病毒VCA-IgA抗体阴性鼻咽病人的远期疗效.癌症，1995，14：115-117.

(收稿：1999-06-07　　修回：1999-10-06)