脂质体介导的HSV-TK基因治疗人膀胱癌

中华实验外科杂志 1999年第1期第16卷 膀光肿瘤

作者：叶传忠　陈仕平　裴雪涛　冯凯　李梁　杨光

单位：350001　福州，福建医科大学附属协和医院泌尿外科(叶传忠，陈仕平)；军事医学科学院放射医学研究所(裴雪涛、冯凯、李梁、杨光)

　　关键词： 膀胱肿瘤；基因治疗；单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶；脂质体

　　【摘要】　目的　探讨HSV-TK基因/GCV系统对人膀胱癌细胞的杀伤作用。方法　以潮霉素磷酸转移酶和HSV-TK的融合基因(HyTK)作为目的基因，利用阳离子脂质体将其转入人膀胱癌细胞株，检测其表达及GCV对转基因细胞的杀伤作用。结果　RT-PCR检测证实HyTK在转基因细胞的表达，MTT法测定示GCV对EJ/HyTK细胞有明显的杀伤作用。其IC50值为2.4mg/L，而对其亲代EJ细胞无明显毒性(P＜0.05)。按不同比例混合EJ/HyTK细胞和亲代EJ细胞，发现GCV不仅能杀伤转入TK基因的细胞，而且对其周围未转基因的膀胱癌细胞存在旁观者效应。结论　HSV-TK基因/GCV系统可作为膀胱癌基因治疗的一种有效方法。

　　 Liposome-mediated HSV-TK gene in the treatment of human bladder carcinoma Ye Chuanzhong^*, Chen Siping, Pei Xuetao, et al. ^*?Department of Urology, Xiehe Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350001

　　 　　【Abstract】 Objective To study the therapeutic effect of hygromycin phosphotransferase-thymidine kinase fusion gene (HyTK) GCV on human bladder carcinoma cell line (EJ cell). Method HyTK genes were transferred into EJ cells by using liposome-mediated transfection technique. HyTK gene expression was detected and antitumor effects observed after GCV treatment. Result In vitro experiments, the EJ cells transferred by HyTK gene were killed in the presence of GCV treatment. Nontransduced parental cells seemed not to be sensitive to GCV (P＜0.05). When EJ/HyTK cells were mixed with parental EJ cell at various ratios, GCV not only killed EJ/HyTK cells, but neighboring cells without Hy-TK by the bystander killing. Conclusion Liposome-mediated HyTK/GCV system may be used as a promising suicide gene therapy for bladder carcinoma.

　　 　　【Key words】 Bladder carcinoma Gene therapy　　Herpes simplex virus-thymidinenase Liposome

　　我们利用真核表达载体将潮霉素磷酸转移酶和单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶的融合基因(HyTK)转染人膀胱癌细胞株，了解HSV-TK/GCV系统对膀胱癌的杀伤作用。

　　材料与方法

　　1. 质粒tgCMV/HyTK的提取和鉴定　质粒tgCMV/HyTK由第三军医大学西南医院王征旭博士惠赠，内含2.0kb潮霉素磷酸转移酶和HSV-TK融合基因的cDNA^［1］，根据文献［2］方法制备XL1-blue菌感受态，电穿孔法转化，快速少量制备质粒DNA，紫外分光光度计定量，Xho1、BamH1双酶切鉴定。

　　2. 细胞的培养　人膀胱癌细胞株EJ由北京医科大学泌尿外科研究所提供，生长于DMEM培养基，其中含10%胎牛血清，200mmol/L的L-谷氨酰胺和1mmol/L HEPES。培养于5%CO₂，37℃培养箱中。

　　3. Lipofectin转染条件的优化　含绿色荧光蛋白(GFP)的真核表达载体PCM(GFP)由军事医学科学院二所胡志远硕士惠赠，接种2×10⁵EJ细胞于6孔培养板，至细胞汇合程度达40%左右，将GFP质粒定量为2μg，分别调节Lipofectin(Gibco公司)用量及孵育时间(由6小时开始)，荧光显微镜下观察，确定出最佳转染条件。

　　4. 转染　用Lipofectin将tgCMV/HyTK质粒转染EJ细胞，表达48小时后潮霉素(400mg/L Boehringer-mannheim)加压筛选，挑取抗潮霉素的阳性克隆继续培养传代。

　　5. RT-PCR　检测转基因细胞的HyTK表达情况　参照Trizol RNA提取试剂盒说明书(Gibco公司)的流程提取EJ/HyTK细胞mRNA，甲醛琼脂糖变性电泳鉴定RNA质量。按逆转录试剂盒(Promega公司)说明书提供的方法合成cDNA。取2.5μl cDNA用于PCR扩增，50μl体系：200μm dNTPs、1.5mmol/L Mg²⁺、4种引物各0.5μmol/L，95℃预变性1分钟，加Taq酶2U(Promega公司)，PCR仪上扩增：94℃变性45秒，60℃退火45秒，72℃延伸30秒，30个循环后72℃延伸7分钟，2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，GDS800型凝胶图像分析系统(UVP公司)成像。

　　6. MTT法检测EJ/HyTK细胞对GCV的体外敏感性　按文献［3］方法并稍加改进：将EJ/HyTK和ET细胞分别接种96孔板，每孔细胞数为3.6×10³，加入GCV使终浓度分别为100、10、1、0.1、0.01mg/L，每一浓度作4个复孔，常规培养68小时后加入MTT 20μl(5g/L)，4小时后酶联仪测定490nm波长的光密度(OD)值。计算杀伤率并IC50值。

　　7. 旁观者效应测定　按文献［4］提供的方法进行，将EJ/HyTK细胞和EJ细胞按不同比例混合，加入使终浓度为10mg/L的GCV，PBS作为阴性对照，培养72小时后台盼蓝拒染法计数活细胞数，计算杀伤率。

　　结　果

　　1. 获得的质粒DNA溶于50μl dH₂O，浓度为0.37g/L，酶切后获得2.7kb及2.2kb的片段各一，符合其物理图谱。

　　2. 荧光显微镜下观察、比较转染效率，认为在6孔板中：1×10⁵细胞、2μg DNA、10μl Lipofectin、转染20小时为转染EJ细胞的最佳条件，转染效率可达25%左右。

　　3. 转染　根据以上优化条件进行，经潮霉素(400mg/L)加压筛选3周，获得抗潮霉素的抗性克隆，继续培养传代，100mg/L潮霉素维持。

　　4. 用合成的cDNA行PCR检测，可特异性扩增出530bp的HyTK基因片段和249bp的β-actin基因片段两条明显亮带。而其亲代EJ细胞则未扩出此片段，从而证实有HyTK基因的插入并有HyTKmRNA的表达。

　　5. GCV对EJ/HyTK细胞的体外杀伤作用(图1)：GCV对EJ/HYTK细胞有明显的杀伤作用。其IC50值为2.4mg/L，而对其亲代EJ细胞无明显毒性(P＜0.05)。

图1　不同浓度GCV对膀胱癌细胞EJ/TK及EJ的杀伤作用

　　6. 旁观者效应　在GCV浓度为10mg/L时，按不同比例混合EJ/HyTK细胞和亲代EJ细胞的生长情况(图2)：GCV不仅能杀伤转入HyTK基因的细胞，而且对其周围未转基因的膀胱癌细胞存在旁观者效应。

图2　GCV对不同比例混合细胞的杀伤率

　　讨　论

　　我们利用阳离子脂质体将质粒tgCMV/HyTK导入人膀胱癌细胞株，并获得了表达。当用其特异性底物GCV处理时，可发现有明显的杀伤作用，而对照组的膀胱癌细胞仅少量被杀死。本实验还表明将表达HyTK的膀胱癌细胞暴露于GCV后，与之共培养的HyTK阴性细胞也被杀死，即所谓的“旁观者效应”，它可能的机制有(1)磷酸化的GCV通过缝隙连接或其他细胞间转运到周围细胞；(2)通过凋亡小体的转运；(3)免疫因素：TK基因治疗TK/GCV治疗后的肿瘤组织局部表达多种炎性细胞因子的mRNA(IL-2、INFg、IL-12及GM-CSF)，且肿瘤消褪后的动物体内诱导出更强的特异性细胞CTL^［5］。HSVTK/GCV系统对EJ细胞的直接杀伤及旁观者效应说明了应用其治疗膀胱癌的可行性。

　　(解放军总医院刘英硕士，协和医大杜权博士曾对本研究给予多方帮助，在此表示感谢)

　　 参考文献

　　1　Lupton SD, Brunton LL, Kalberg VA, et al. Dominant positive and negative selection using a hygromycin phosphotransferase-thymidine kinase-fusion gene. Molecular and Cellular Biology, 1991,11:3374-3378.

　　2　Sheng Y, Mancino V, Birren B. Transformation of Escherichia coli with large DNA molecules by electroporation. Nucleic. Acids Res, 1995,23:1990-1996.

　　3　Stein U, Walther W, Shoemaker RH.Reversal of multidrug by transduction of cytosine genes into human colon carcinoma cells. J of the National Cancer Institute, 1996,88:1383-1391.

　　4　Kwong YL, Hen SH, Savio LC. Methods for cancer gene therapy. Current Protocols in Human Genetics. Copyrighto 1997 by John&Sons, Inc, 1997,13.5.5-13.5.6.

　　5　Paillard F. Suicide genes against brain tumor. Human Gene Therapy, 1998,9:3-5.

(收稿：1998-05-11　修回：1998-09-10)