应用逆转录-聚合酶链反应技术检测乳腺癌骨髓微转移

中华外科杂志 2000年第3期第38卷 论著摘要

作者：李金锋　张蕾　孙素莲　林本耀　徐光炜

单位：李金锋　林本耀　徐光炜（100036 北京医科大学临床肿瘤学院乳腺外科）；张蕾　孙素莲（免疫学研究室）

　　我们利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术，以上皮源性细胞特异性标志基因—细胞角蛋白19（CK-19）的表达为标志物，对我院外科收治的54例可手术的原发性乳腺癌患者的骨髓，进行了微转移的检测，并结合其它参考指标探讨其临床意义。

　　1．资料与方法：（1）临床资料：本组患者54例，均为女性，年龄26.0～75.0岁，平均52.6岁。绝经前18例，绝经后36例。手术方式：根治术2例，改良根治术51例，1/4乳腺切除加腋清扫1例。肿瘤大小：直径≤2.0 cm 23例，2.1～5.0 cm 20例，＞5.0 cm 11例。激素受体检查：检查48例，ER阳性24例，阴性24例；PR阳性15例，阴性33例。（2）方法：试剂与细胞株：TaqDNA多聚酶为芬兰DYNAZYMES OY公司产品，逆转录酶及RNA提取试剂盒购自GIBCO公司。3′末端标记及化学发光检测试剂盒为NEN^TMLIFE SCIENCE公司产品。T47D人乳腺癌细胞株为本研究所免疫室提供。引物及探针：序列按文献［1］。标本采集：术前抽取胸骨骨髓标本，分离淋巴细胞， －70 ℃保存备用。另取常规病理检查有转移（RPE+）的淋巴结6枚做阳性对照，8份正常骨髓标本做阴性对照。敏感性实验：将T47D细胞按不同比例与正常骨髓淋巴细胞混合，分别行细胞涂片免疫组化（IHC）染色和提取总RNA。提取RNA及RT-PCR扩增：均按试剂盒说明书进行。PCR产物分析：阳性结果为460 bp扩增条带。PCR产物鉴定：将阳、阴性对照标本的PCR扩增产物行Southern杂交。DNA转膜、探针标记及杂交检测均按试剂盒说明书进行。IHC染色：SP法，鼠抗人单抗CK-19为一抗，程序按说明书进行。阳性细胞胞浆呈棕褐色着色。统计学处理：采用χ²检验。

　　2．结果：（1）CK-19的检测：6枚RPE+淋巴结均出现460 bp（CK-19阳性）特异性扩增条带，8份正常骨髓标本则仅有β-actin之317 bp扩增条带出现,Southern杂交证实阳性扩增条带即为CK-19基因表达。（2）CK-19检测敏感性：T47D细胞与骨髓细胞按不同比例混合，RT-PCR法检测CK-19阳性表达上限为1∶5×10⁵；IHC法检测骨髓细胞涂片，1∶5×10⁴时能发现胞浆棕染的肿瘤细胞，说明前者比后者敏感10倍。（3）微转移的检出率：本组54例中检出微转移14例（25.9%），其中19例淋巴结转移阳性者，6例CK-19表达阳性（31.6%）；而淋巴结转移阴性的35例中有8例表达阳性（22.9%）。（4）微转移与其它临床指标的关系：随着肿瘤体积的增大，微转移的出现机率亦增加，肿瘤最大直径≤2.0 cm者，阳性率13.0%，直径＞5.0 cm者为72.7%，差异有显著性意义(P＜0.05)。微转移与月经状态、激素受体情况及病理类型等临床指标无相关性。

　　3．讨论：乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一,且近年来发病率仍有上升趋势。肿瘤细胞的转移是主要致死因素，骨及骨髓是乳腺癌常见转移部位，现有检查手段仅当骨基质（bone matrix）出现破坏时才有意义。如何对处于亚临床阶段的微小转移灶进行检测越来越受到肿瘤学家的青睐。常规细胞学检查对无骨转移临床症状的患者阳性率甚低，最高仅3.6%。IHC检测使检出率提高至16%～48%，但对于组织学和IHC检查骨髓微转移阴性的患者，仍有10%以上术后出现复发^［2］。近年来RT-PCR技术用于肿瘤微转移的检测，敏感性比IHC提高10～100倍。本研究对54例原发性乳腺癌患者行RT-PCR微转移检测，阳性率25.9%（14/54）。随着肿瘤体积的增大，微转移检出率亦明显增加。但检测敏感性仅为1∶5×10⁵，可能与不同标志基因在不同细胞株的表达差异有关。

　　RT-PCR的特异性依赖于肿瘤细胞特异或过量表达基因的检测。CK-19做为上皮性细胞的标志基因，几乎在所有上皮细胞均有表达^［3］，可做为乳腺癌在淋巴结、骨髓和外周血等间叶组织转移的标志物。本研究6例RPE+淋巴结均呈阳性表达，而8份正常骨髓标本均呈阴性表达，并经Southern杂交证实，亦证明CK-19做为转移标志基因的特异性和可靠性。

　　关于RT-PCR方法检出微转移的临床意义，由于此项技术应用时间较短，目前尚无定论。我们认为，RT-PCR方法是目前检测肿瘤微转移灵敏、特异的手段之一，阳性结果至少提示其具有形成转移的倾向，并可作为判断预后的辅助参考指标。

　　基金项目：北京市乳腺癌重点学科发展基金

　　参考文献：

　　［1］Noguchi S, Aihara T, Motomura K, et al. Histologic characteristics of breast cancers with occult 　lymph 　node 　metastases detected by keratin 19 mRNA reverse transcripase-polymerase chain reaction. Cancer,1996,73:1235-1240.

　　［2］Cote RJ,Rosen PP, Lesser ML,et al. Prediction of early relapse in patients with operable breast 　cancer by 　detection of 　occult bone morrow micrometastases. J Clin Oncol,1991,9:1749-1756.

　　［3］Kwspen FHL, Smedts FMM, Broos A, et al. Reproducible and highly sensitive detection of the broad spectrum epithelial marker keratin 19 in routine cancer diagnosis. Histopathology,1997,31:503-516.

收稿日期：1999-02-11