T细胞白血病病毒I型相关的病毒抗原在Graves'病中表达的研究
中华内分泌代谢杂志 1999年第3期第15卷 论著摘要
作者：张强 宋作徐荣臻
单位：310009 浙江医科大学附属第二医院内科
Graves'病(GD)的病因及发病机理至今未明。单卵双生者相继得本病的共显率只有30%～60%，提示除遗传因素外，环境因素也起作用。已发现微生物感染作为自身免疫性甲状腺疾病的致病因素〔1〕。近年国外研究显示逆转录病毒与GD有联系〔2〕，本研究通过分离GD患者及健康人的外周血单个核细胞(PBMNCs)，采用直接免疫金银染色法(direct immuno gold silver staining, D-IGSS)，从新鲜标本和体外培养两方面测定人类T细胞白血病病毒I型(HTLV-I，又称人类亲T淋巴细胞病毒I型)相关的逆转录病毒抗原，同步测定逆转录酶活性，就逆转录病毒与GD的关联性进行探讨。
一、对象与方法
1.研究对象及试剂：(1)病人组：GD患者54人，均为本院内分泌专科门诊或住院病人，男18例，女36例，年龄(32.4±10.1)岁(10～50岁)；对照组：健康助血员20例，男7例，女13例，年龄(34.8±9.5)岁(18～47岁)，结节性甲状腺肿患者20例，男6例，女14例，年龄(33.2±10.1)岁(16～48岁)，标本为外周静脉血5ml。(2)HTLV-I抗血清：系日本成人T细胞白血病病人抗体阳性抗血清，效价1:1 280，由日本九州大学医学部提供。
2.方法：(1)免疫金探针的制备：首先制备直径为10nm胶体金颗粒，然后按Horisherger等人方法〔3〕将纯化的HTLV-I抗体标记到胶体金颗粒上，再进行纯化，制备特异性的免疫金探针，效价1:40。(2)细胞分离与培养：用Ficoll-hypaque 密度梯度分离液无菌分离单个核细胞，分两部分：一部分测定新鲜细胞中HTLV-I相关抗原和逆转录酶活性，另一部分用RPMI-1640(Sigma公司)不完全培养液洗涤两次，用含20%小牛血清(BSA)RPMI-1640完全培养液将细胞浓度调至1-2×106/ml，加适量PHA及IL-2，置培养瓶37℃密闭培养48小时，然后离心取细胞测HTLV-1相关抗原及逆转录酶(RT)活性。(3)HTLV-I相关逆转录病毒抗原测定：采用直接免疫金银染色法：细胞涂片干燥后用1%戊二醛固定5分钟，流水冲洗后用1%牛血清白蛋白封闭10分钟，磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7.6，含Tween-20)冲洗5分钟，室温干燥后加入稀释液(含1% BSA，0.5% Tween-20的PBS)稀释的免疫金探针(效价1:20)，置37℃孵育2小时，然后PBS冲洗3次，每10分钟左右，用双蒸水冲洗，甲基绿复染，在光镜下检查反应结果。反应标准：阴性，细胞无黑褐色颗粒；阳性，细胞周围呈黑褐色环(多数由颗粒状或块状褐色银颗粒组成)，有时整个细胞呈黑褐色。(4)逆转录酶活性测定，将1×107细胞用玻璃匀浆器研磨，其匀浆离心(12 000g)20分钟，取上清液加入PEG-6000至终浓度10%，4℃冰箱过夜，离心取沉淀物，然后加入适量反应缓冲液，反应缓冲液中包括0.02mmol/L BrdUTP，10μg/ml Poly A，10mmol/L DTT，0.05% TritonX-100等，取上述反应混合物100μl加入40孔微量反应板，反应板上已交联Oligo T 12-18，然后按Urabe〔4〕和Postmann等〔5〕人方法用BrdU多克隆抗体测定聚合的BrdU(OD=490nm)。
二、结果
54例GD患者中，有36例有不同程度的HTLV-I相关抗原的表达，其阳性检出率为66.7%，培养前(新鲜标本)抗原阴性的标本经培养后仍然阴性；培养前阳性的标本培养后仍然阳性，但经培养后，阳性细胞所占的平均百分数明显增高，从培养前的12%提高到25%。20例健康对照组不表达HTLV-I相关抗原，20例结节性甲状腺肿患者标本也均为阴性。GD组与对照组存在显著差异(χ2=25.96,P＜0.001)。
为进一步明确HTLV-I相关抗原与逆转录病毒的关系，对19例GD患者的标本进行逆转录酶(RT)活性分析，结果HTLV-I相关抗原阳性的标本同时表达RT活性，且其活性随着抗原表达的增加而增高，两者呈正相关，r=0.98(Spearman法)，P＜0.01。
三、讨论
Yamaguchi等〔6〕调查93例HTLV-I抗体阳性的眼葡萄膜炎患者，其中16例有GD病史，而另外222例HTLV-I抗体阴性的眼葡萄膜炎患者均无GD病史。Nakao等〔7〕报道76例原因未明的眼葡萄膜炎患者中，6例有GD病史，而这6例患者血清中均存在HTLV-I抗体。上述研究均提示GD可能与HTLV感染有关。本研究显示约66.7%(36/54)的GD患者体内有HTLV-I相关的逆转录病毒抗原存在，且标本的逆转录酶(RT)活性随HTLV-I抗原阳性细胞百分数的增加而增高，从而排除了细胞自身抗原“分子模拟”的可能。阳性标本经培养后阳性细胞的平均百分率明显增高(从12%提高到25%)，考虑是免疫系统对病毒复制与表达的抑制减弱所致。
尽管近来有学者研究后认为逆转录病毒与HLA-II类抗原易感基因的相互作用是GD发病的主要原因〔8〕，但有关逆转录病毒在自身免疫过程中的地位及作用等问题目前尚不清楚。研究提示，逆转录病毒与GD可能有较密切的关系，此为GD的病因学及致病机理研究提供了新的线索。
参考文献
1 Tomer Y, Davies TF. Infection, thyroid disease and autoimmunity. Endocr Rev, 1993,14:107-120.
2 张强，徐荣臻，宋作. 自身免疫性甲状腺疾病与逆转录病毒的研究，国外医学内科学分册， 1997，11：478-480.
3 Horisberger M, Rosset J. Colloidal gold, a useful marker for transmission and scanning electron microscopy.J Histochem Cyto-chem, 1977,25:295-305.
4 Urabe T, Sano K, Tanno M, et al. A non-radioisotopic reverse transcriptase assay biotin-ll-deoxyuridine-triphosphate on primerimmobilized microtiter plates. J Virol Meth, 1992,40:145-154.
5 Porstmann T, Meissner K, Glaser R, et al. Asensitive non-isotopic assay specific for HIV-1 associated reverse transceptase. J Virol Meth, 1991,31:181-188.
6 Yamaguchi K, Mochizuchi M, Watanabe T, et al. Human T-cell lymphotropic virus type I uveitis after Graves disease. Br J Ophthalmol, 1994,78:163-166.
7 Nakao K, Ohba N, Otsrka S, et al. HTLV-1 associated uveitis and hyperthyroidism, Jpn J Ophthalmol, 1994,38:56-61.
8 Jaspan JB, Sullivan K, Garry L, et al. The interaction of a type A retroviral particle and class human leukocyte antigen susceptibility genes in the pathogenesis of Graves' disease. J Clin Endocrinol Metab, 1996,81:2271-2279.
(收稿：1998-04-09 修回：1999-04-09)
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