抗凋亡基因bcl-x_L与白血病细胞耐药的相关性研究

癌症 2000年第6期第19卷 基础研究

作者：白庆咸　黄高升　杨平地　杨岚　陈协群　张永清　乔庆大

单位：黄高升（第四军医大学西京医院基础部病理教研室,陕西西安710032）；白庆咸　杨平地　杨岚　陈协群　张永清　乔庆大（第四军医大学西京医院血液科,陕西西安710032）

关键词：凋亡；白血病,急性髓细胞性；多药耐药

　　【摘要】目的：研究bcl-x_L基因高表达在白血病细胞耐药形成中的作用，观察急性髓细胞白血病病人的bcl-x_L表达与临床疗效间的相关性。方法：采用脂质体法将bcl-x_LcDNA转导入HL-60细胞；流式细胞仪定量检测凋亡细胞；MTT法测定足叶乙甙、柔红霉素、阿霉素对转染细胞的细胞毒性；RT-PCR法检测20例急性髓细胞白血病病人的bcl-x_L表达。结果：bcl-x_L高表达可抑制足叶乙甙诱发的凋亡,抑制率为40.5％；降低上述化疗药物的细胞毒作用，耐药指数分别为3.2、3.2、1.6。16/20例急性髓细胞白血病病人bcl-x_L阳性，其中7例bcl-x_L强阳性表达，仅2例(28.6％)获得完全缓解；9例bcl-x_L弱阳性表达，6例(66.7％)获得完全缓解。结论：bcl-x_L可能作为一种新的耐药途径，通过抑制化疗药物诱发的细胞凋亡参与多药耐药的形成，可以作为预测耐药及判定预后的一种参考指标。

　　中图分类号：R733.71　文献标识码：A

　　文章编号：1000－467X(2000)06－0530－04

Relationship of anti－apoptosis gene bcl－xL and

　　multidrug resistance in leukemia cells

BAI Qing－xian, HUANG Gao－sheng, YAN Ping－di, et al.

　　Department of hematology, Xijing Hospital,Department of pathology,

　　Faculty of Preclinical Medicine,Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, P.R.China.

　　【 Abstract】 Objective: To investigate the role of bcl－x_L gene in development of multidrug resistance and to observe the relationship between the expression of bcl－xL in acute myeloid leukemia and clinical response. Methods: bcl－x_L cDNA was transfected into HL－60 cells using lipofictamine. The apoptotic rate was quantitatively analyzed with FCM. The cytotoxicity of chemotherapy drugs in vitro was compared employing the MTT assay. RT－PCR was applied to detect the expression of bcl－x_L in 20 patients with acute myeloid leukemia. Results:The overexpression of bcl－x_L in HL－60 cells inhibited the etoposide－induced apoptosis by 40.5％ and decreased the cytotoxicity of etoposide、 daunorubicin and adriamycin. The resistance factors were 3.2, 3.2, 1.6,respectively. Sixteen of 20 patients with acute myeloid leukemia expressed bcl－x_L mRNA. Only 2/7(28.6％ )cases with higher level of bcl－x_L mRNA achieved complete remission,while 6/9(66.8％ ) cases with lower level of bcl－x_L mRNA got complete remission. Conclusion: bcl－x_L gene might be involved a new multidrug resistance phenotype through inhibiting the apoptosis induced by chemotherapeutic agents. The detection of bcl－xL gene also provides a new parameter to predict the prognosis of acute myeloid leukemia.

　　Key words: Apoptosis; Leukemia, myeloid, acute; Drug resistance multiple

　　白血病细胞多药耐药的产生是急性白血病复发、难治的根本原因。细胞的凋亡作为大多数化疗药物抗肿瘤作用的机理之一，其障碍极有可能作为一种新的耐药途径参与多药耐药的形成。bcl-_x为一凋亡相关基因，具有两种RNA拼接形式—长型bcl-_xL及短型bcl-_xS，其中bcl-_xLmRNA编码的蛋白功能类似bcl-2,可使细胞耐受细胞生长因子撤除诱导的凋亡^[1]。研究发现，鼠白血病细胞在体外长期传代培养过程中自发形成的耐药亚株及化疗药物诱导产生的人白血病耐药细胞株均表达较高水平的bcl-_xL蛋白^[2,3]。为明确bcl-_xL基因与白血病细胞耐药的相关性，我们采用脂质体法将bcl-_xL基因转导入HL-60细胞中，观察该基因高表达对白血病细胞凋亡易感性及化疗药物敏感性的影响；并进一步观察bcl-_xL在临床急性髓细胞白血病细胞(acutemyeloidleukemia,AML)，mRNA水平的表达与化疗效果的相关性。

　　1　材料和方法

　　1.1逆转录病毒表达载体

　　人全长bcl-_xLcDNA(由美国ThompsonC.B.教授惠赠）正向插入逆转录病毒载体pDOR-neo,重组表达载体称为pDSBL^[4]。

　　1.2　细胞系及基因转染

　　参照Gibco公司产品说明书。将2×106处于对数生长期的HL-60细胞（中国科学院上海细胞生物研究所提供，常规培养于含10％胎牛血清的RPMI1640液中）悬浮于0.8ml无血清无抗生素的RPMI1640液中。3～5μg质粒DNA（pDSBL或pDOR-neo）与10μl脂质体LipofecAMINE(GibcoBRL)分别溶于100μl同样培养液中，然后将两液混合，室温放置15min以形成脂质体-DNA复合物。将此混合物逐滴缓慢加入细胞悬液内，37℃、5％CO₂条件下孵育6h，加入4ml含15％胎牛血清的RPMI1640液继续培养60h。离心收集细胞备用。

　　1.3　凋亡细胞的定量检测

　　参照前期试验的诱导凋亡条件。5×10⁵/ml的转染细胞与10mg/L足叶乙甙孵育5h,PBS洗涤后收集细胞共4×10⁶。预冷的70％酒精固定1h，碘化丙锭(PI)染液(含50μg/mlPI、1ml/LTritonX-100,100μg/mlRNaseA)染色30min，流式细胞仪(FCM)检测。资料经LysisII软件收集、贮存、分析。

　　1.4　细胞毒测定（MTT法）

　　靶细胞以2×10⁴/孔，100μl体积接种于96孔板，37℃、5％CO₂孵箱内过夜。然后分别加入不同浓度的足叶乙甙(Merck)、柔红霉素、阿霉素(Phamarcia)孵育24h。每孔加入MTT100μg，继续孵育4h，小心吸弃上清。各孔加150μl二甲基亚砜，振荡后测每孔隙A490nm值，计算杀伤率。对数纸作图，求IC50值。

　　1.5细胞内药物浓度测定

　　取2×10⁵/ml对数期生长的细胞，PBS洗涤、离心后，重悬于RPMI1640液中，加入柔红霉素10mg/L,37℃孵育1h，预冷的PBS洗涤3次。台盼蓝染色活细胞数需大于97％。然后，样品经流式细胞仪检测。

　　1.6　白血病病例及单个核细胞（MNC）的制备

　　20例初治的AML为第四军医大学附属西京医院血液科收治病例，病例以FAB分型，M13例，M27例，M34例，M54例，CML急性变2例。年龄14～59岁。予HA、DA方案化疗2个疗程，采用1987年苏州全国白血病化疗讨论会疗效判定标准。全部病例均于化疗前采集骨髓,取抗凝骨髓2～3ml，PBS稀释1～2倍，Ficoll淋巴细胞分离液5ml，2000r/min离心15分钟，吸取白膜层，PBS洗涤3次，计数后备用。

　　1.7　RT-PCR

　　采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA,cDNA合成:逆转录反应体系20μl，包括细胞总RNA1μg，5×逆转录反应缓冲液4μl，2.5mmol/LdNTP4μl,oligodt182μl,M-MLV反转录酶(Gibco)200U,37℃反应60min，99℃5min终止反应。PCR反应体系50μl,包括逆转录产物4μl,寡核苷酸引物各5pmol,2.5mmol/LdNTP4μl,10×PCR反应缓冲液5μl,TaqDNA聚合酶(华美公司)1.5U,在PCR扩增仪上（PE公司）扩增。bcl-_x及β-actin反应条件：94℃45s，55℃40s，72℃50s。35个循环。bcl-_x引物设计参照文献^[5],bcl-_x正向引物：^5’CGGGCATTCAGTGACCTGAC^3’，反向引物：^5’TCAGGAACCAGCGGTTGAAG^3’。作为内对照的β-actin，其引物序列正向引物：^5’ACACTGTGGCCATCTACGAGGGG^3’，反向引物：^5’ATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGAT^3’。bcl-_x扩增片断为340bp的长型bcl-_xL及151bp的短型bcl-_xS。bcl-_xL的PCR产物半定量分析：薄层扫描仪测定bcl-_xL与β-actin的相对比值，二者之比大于1定为强阳性(＋＋)，小于1定为弱阳性(＋)。

　　1.8　统计学分析

　　采用t检验。

　　2　结果

　　2.1　bcl-_xL高表达抑制足叶乙甙诱发的凋亡

　　转染bcl-_xL的HL-60细胞(HL-60/bcl-_xL)及对照细胞（HL-60/neo）经足叶乙甙处理后，FCM定量分析显示HL-60/bcl-_xL细胞的凋亡比例明显减少，由HL-60/neo细胞的39.3％降为23.3％，抑制率为40.5％，并且HL-60/bcl-_xL细胞的G₁期比例增高（表1）。

　　2.2　转染bcl-_xL的HL-60细胞对化疗药物的敏感性降低

　　MTT法显示：足叶乙甙、柔红霉素、阿霉素对HL-60/bcl-_xL细胞的细胞毒作用有不同程度的降低,IC50增高。HL-60/bcl-_xL细胞对上述3药的IC50值分别升至对照细胞的3.2、3.2及1.6倍(表2)。

　　2.3　转染细胞中药物浓度的改变

　　柔红霉素处理细胞后，通过流式细胞仪检测细胞内柔红霉素的红色荧光强度，以确定细胞内相对药物浓度。实验结果显示转染细胞及对照细胞内的相对药物浓度无显著差异。

　　2.4白血病细胞中bcl-_x的RNA表达形式以及与化疗疗效的关系

　　RT-PCR结果显示：20例AML的内对照β-actin均为阳性。白血病细胞株HL-60、U937及16例AML可测及bcl-_x的PCR产物，除1例仅表达bcl-_xL，其余均可见bcl-_xL及bcl-_xS片断(图1)。半定量分析显示，bcl-_x阳性的16例AML中，bcl-_xL强阳性表达7例，仅2例（28.6％）获得完全缓解；bcl-_xL弱阳性表达9例，6例(66.7％)获得完全缓解。bcl-_xL阳性表达强度与FAB分型无相关性。

表1　bcl-_xL表达抑制Vp-16诱导HL-60细胞凋亡的FCM 检测结果（%）

表2　bcl-_xL降低HL-60细胞对化疗药物的敏感性（n=3,±s）

IC₅₀:杀伤50％细胞所需的药物浓度；RF:耐药细胞与对照敏感细胞的IC₅₀值之比；＊＊P值≤0.01＊P值≤0.05

　　3　讨论

　　白血病细胞多药耐药的产生是化疗失败的主要原因。既往已有较多研究发现，经典耐药机制膜糖蛋白(p170、p180)具有外排泵功能，可以将进入细胞内的药物泵出细胞外，降低细胞内药物浓度。膜糖蛋白(p170、p180)在急性髓细胞白血病中高表达与化疗失败密切相关^[6]。我们的结果显示，bcl-_xL在HL-60细胞中高表达可降低足叶乙甙、柔红霉素、阿霉素的细胞毒作用。细胞内柔红霉素的浓度并无改变，这说明bcl-_xL介导的耐药，其机理不同于膜糖蛋白。bcl-_xL可能在药物作用的较下游，即通过调节药物作用的终环节——靶细胞的凋亡而发挥作用。我们的实验证明，bcl-_xL导入HL-60细胞后，高表达的bcl-_xL可抑制足叶乙甙诱发的HL-60细胞凋亡。与Minn等^[7]的结果一致,他们将bcl-_xL转染入鼠前淋巴细胞系FL5.12，可使该细胞耐受多种细胞毒药物引发的凋亡。这表明bcl-_xL很可能作为一种新的耐药机制，通过抑制细胞凋亡介导耐药的形成。

　　bcl-_x表达与AML预后是否相关，文献存在分歧。Stoetzer^[8]等应用免疫组化方法观察14例AML病例白血病细胞凋亡相关蛋白bcl-x、bcl-2、bax及ICE与初次化疗反应的关系，结果显示bcl-2/Bax比值与预后相关，比值＜1,易达到缓解(completeremission,CR)，＞1则较耐药；但bcl-_x、p170及ICE表达与CR无相关。Pallis等^[9]用流式细胞仪定量检测急性白血病病例中的bcl-_x阳性细胞，发现其阳性表达率与细胞的自主性生长特征有相关性，是预后不良的指标之一。国内周剑锋等^[10]采用Northernblot分析技术，观察到16例急性髓系白血病有8例bcl-_xL高表达，并且bcl-_xL高表达与高白细胞数、髓外浸润等不良预后特征及化疗耐药性相关。我们目前的病例资料分析也显示，bcl--_xL的阳性强度与预后相关，强阳性提示不易达到CR。因此，我们认为bcl-_xL可以作为耐药的一种参考指标，并结合其它临床资料判定AML病人的预后。

图1AML病例、白血病细胞株及正常骨髓的bcl-_x表达

　　1.marker,151bp为bcl-_xS,340bp为bcl-_xL;

　　2,3.白血病细胞株;4～11.AML病例;12,13.正常骨髓

　　基金项目：本课题受国家自然科学基金（No.39400057）资助

　　参考文献

　　1，Boise LH, Gonzalez－Carcia M, Postema CE, et al. bcl－x, a bcl－2－related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death [J]. Cell,1993,74(4):597～ 608.

　　2Kuhl JS, Krajewski S, Duran GE, et al. Spontaneous overexpression of the long form of the Bcl－X protein in a highly resistant P388 leukemia [J]. Br J Cancer, 1997,75(2): 268～ 274.

　　3，Han Z, Chatterjee D, Early J, et al. Isolation and characterization of an apoptosis－resistant variant of human leukemia HL－60 cells that has switched expression from Bcl－2 to Bcl－XL [J]. Cancer Res, 1996, 56(7): 1621～ 1628.

　　4，白庆咸,黄高升,陈协群.重组bcl－xL逆转录表达载体的构建及鉴定[J].第四军医大学学报,1997，18(5):封3.

　　5，Benito A, Silva M, Grillot D,et al. Apoptosis induced by erythroid differentiation of human leukemia cell lines is inhibited by Bcl－X_L [J]. Blood,1996, 87(9),3837～ 3843.

　　6，Arceci RJ. Clinical significance of P－glycoprotein in multidrug resistance malignancies [J]. Blood, 1993, 81(9):2215～ 2222.

　　7，Minn AJ, Rudin CM, Boise LH ,et al. Expression of Bcl－xL can confer a multidrug resistance phenotype [J]. Blood, 1995,86(5):1903～ 1910.

　　8，Stoetzer OJ, Nussler V, Darsow M,et al. Association of bcl－2, bax, bcl－xL and interleukin－1 beta－converting enzyme expression with initial response to chemotherapy in acute myeloid leukemia [J]. Leukemia, 1996,3:S18～ S22.

　　9，Pallis M, Zhu YM, Russell NH. Bcl－x_L is heterogeneously expressed by acute myeloblastic leukemia cells and is associated with autonomous growth in vitro and with P－glycoprotein expression [J]. Leukemia, 1997,11(7):945～ 949.

　　10，周剑锋，陈燕，李崇渔,等.bcl－x_L在急性髓系白血病细胞的表达及与化疗敏感性的关系[J].中华血液学杂志,1997,18(11):584～586.

收稿日期：1999－11－26；修回日期：2000－02－01