癌光啉体外净化骨髓中残留白血病变后行自体骨髓移植治疗白血病

　　军医进修学院学报2000年第21卷第1期

楼方定　张伯龙　高春记　周绮　张苗　顾群　姚善谦　刘海川

　　摘　要：目的：为减少白血病患者自体骨髓移植后白血病复发率和提高长期无病存活率。方法：采用缓解期急性非淋巴细胞白血病患者的骨髓细胞在体外经处理后用癌光啉(浓度为10μg/ml)加光照净化，待患者完成预处理后回输给自身。结果：10例急性髓细胞白血病患者接受了本净化方法后移植治疗。净化后输入有核细胞中位数1.30(0.7～2.45)×10⁸/kg，CD34^＋细胞中位数2.39(0.74～4.06)×10⁶/kg，CFU-GM中位数1.44(0.32～4.65)×10⁴/kg。10例中9例造血功能重建，WBC升到＞1.0×10⁹/L中位数时间20(15～43)d，＞2.0×10⁹/L中位数时间30(21～55)d，BPC＞50×10⁹/L中位数时间46(25～62)d。经中位26个(20～64)月随访，有6例仍无病存活；3例复发，其中2例复发后失去随访；1例嗜碱细胞性白血病经化疗再次取得缓解，至今CR₂后又无复发存活14个月；1例死于与移植相关并发症。结论：初步结果表明，用癌光啉加光照净化自体骨髓中残留白血病细胞后行自体骨髓移植治疗白血病是一种安全而有潜力的方法。

　　关键词：髓系白血病；急性；自体骨髓移植；体外净化；癌光啉

　　如何有效地体外净化自体骨髓中的残留白血病细胞一直是国内外血液学工作者的研究课题之一。笔者报告1993 年以来采用癌光啉加光照体外净化自体骨髓后移植治疗 10例急非淋白血病(ANLL)及随访情况。

　　1　对象和方法

　　1.1　对象　10例患者均系男性，年龄14～35岁，中位年龄29岁，经临床、血象、骨髓细胞形态学和免疫分型确诊，有4例作了染色体检查。其中M₁1例，M_2a3例，M_2b1例，M₃2例，M_4EO1例，M₅1例，急性嗜碱细胞白血病1例。诱导缓解用DA(柔红霉素、阿糖胞苷)或HA(三尖杉酯碱、阿糖胞苷)方案，其中M₃用维甲酸，缓解后非M₃用原方案巩固2～3疗程，然后用HAE(HA+足叶乙甙)或DAE方案强化治疗2～3疗程，其中Ara-C用量2.0g3d;M₃白血病经维甲酸缓解后用HA、DA交替巩固治疗4～6疗程，然后行ABMT治疗。从首次完全缓解(CR₁)起至ABMT的中位时间7.5(3～12)个月。

　　1.2　方法

　　1.2.1　骨髓采集　10例首次缓解期患者在移植前采取自身骨髓，将采集到的骨髓先行有核细胞计数和单个核细胞计数，以确定所采骨髓量是否已足够，然后置4℃冰箱短时保存备用。

　　1.2.2　去红细胞　骨髓液与0.5%甲基纤维素按4∶1的比例混匀，室温静止沉降30～40min，将收集的红细胞回输给患者，然后上清部分行有核细胞计数、台盼蓝染色、单个核细胞(MNC)计数、CD34^＋细胞测定和送CFU-GM培养。

　　1.2.3　净化处理　用RPMI1640培养液调整单个核细胞浓度至2×10⁶/ml，加入癌光啉(PSD～007，批号：军制1993FM21313)，其浓度为10μg/ml，适当加入人血白蛋白，在37℃、5%CO₂孵箱内孵育60min，离心洗涤两遍，然后用含5%人AB血清的RPMI1640培养液调整单个核细胞浓度至2×10⁶/ml，分装入1000ml的培养瓶内，平放后液面不高于0.5cm(加PSD-007后的操作过程应避光)，然后光照2min(光源、癌光啉对白血病细胞的杀伤作用的实验研究详见文献^［1］)。

　　1.2.4　预处理　全部患者用环磷酰胺60mg/(kg·d)，2d，阿糖胞苷50mg/kg，全身照射(TBI)7.0Gy，剂量率＜5cGy/min(有2例分2次TBI，余均为1次TBI)。

　　1.2.5　移植后患者处理　所有患者均置于空气层流洁净室，支持治疗、防治各种并发症^［2］。

　　1.2.6　统计学处理　生存期计算从移植日至随访到1999年2月底。净化前后细胞丢失用成对t检验。

　　2　结　果

　　2.1　净化后输入各类细胞数　输入有核细胞中位数1.30(0.7～2.45)×10⁸/kg；输入CD34^＋细胞中位数2.39(0.74～4.06)×10⁶/kg，输入CFU-GM中位数1.44(0.32～4.65)×10⁴/kg。

　　2.2　净化前、后有核细胞数、CD34^＋细胞数和CFU-GM数的变化见附表。

附表　净化前后有核细胞、CD34^＋细胞和CFU-GM数变化

　　注：净化前、后有核细胞数，CD34^＋细胞数和CFU-GM均有明显丢失，P均＜0.012.3　造血功能重建情况　10例中9例患者造血功能得到重建，WBC升到＞1.0×10⁹/L的中位时间为20(15～43)d，＞2.0×10⁹/L中位时间30(21～55)d，BPC＞20×10⁹/L中位时间29(15～43)d，＞50×10⁹/L中位时间46(25～62)d，只有1例在60d时，BPC仍＜20×10⁹/L。

　　2.4　其他　发热37℃以上中位时间10d，中位输血小板200ml×5次。

　　2.5　随访情况　经中位26(20～64)个月随访，有6例仍处于持续缓解状态(其中有1例为M₃)，这些患者从移植起至今已分别无病存活了64个月、43个月、34个月、26个月(M₃)、23和20个月；3例分别在移植后3个月、5和6个月时复发，其中2例失去随访，1例急性嗜碱细胞性白血病经化疗又取得CR₂，CR₂后至今又无复发存活14个月，1例在层流室因血小板迟迟不恢复而死于脑出血。

　　3　讨　论

　　本研究采用癌光啉加光照的光动力学方法在体外净化自体骨髓中的残留白血病细胞。其原理是已知血卟啉衍生物(癌光啉)具有选择性地积聚在癌组织中的特性，在一定波长光照射下可产生单态氧及羟自由基等瞬时产物，通过破坏细胞膜系统而达到选择性杀伤癌细胞的作用^［3］。近年来发展起来的这种光动力学疗法有可能成为继手术、放疗和化疗后的第四种癌症治疗方法。用该方法净化骨髓可在体外进行，副作用少，对放、化疗不敏感的白血病细胞同样具有杀灭作用。实验证明，血卟啉衍生物(癌光啉)经光照后，当白血病细胞杀死率已超过99%时，正常骨髓造血细胞的抑制率尚不到30%，因此是一种较理想的具有选择性地杀死白血病细胞的制剂^［4］。根据我们临床前研究表明，将10例正常骨髓细胞和10例急性髓系原代白血病细胞经与癌光啉孵育，不加光照，通过台盼蓝染色，对正常骨髓细胞及原代白血病细胞杀伤作用均小于5%，但经光照后并随着光照时间的延长，正常骨髓细胞及原代白血病细胞的杀伤作用均增加，而对白血病细胞杀伤作用远高于正常细胞，当光照2min时，正常CFU-GM存活率为(75.28±28.11)%，而白血病祖细胞(AML-CFU)存活率只有(15.57±5.9)%(P＜0.01)，当光照延长到4min时，正常CFU-GM存活率降到(25.08±18.23)%，而AML-CFU存活率只有(5.89±3.00)%(P＜0.05)^［1］，为此我们选用2min光照为其依据。

　　我们用此净化方法对10例AML患者行自体骨髓造血干细胞移植治疗，患者骨髓细胞在体外经去红细胞和用癌光啉加光照2min处理后，有核细胞数、CD34^＋细胞数和CFU-GM数较光照前有明显丢失(P＜0.01)，故输入的上述细胞均低于文献报告的数值^［5］，因此造血功能重建的时间也比我们以前报告的未经净化的ABMT治疗的患者要长^［6］，这与国外有关文献报告的也相一致^［7］。然而一旦造血功能重建，长期无复发存活的例数较高。值得注意的是，复发的3例均发生在移植后半年内，半年后未复发者，目前情况都很好。上述疗效应该说是比较满意的，当然例数尚少，而且病例均为非随机性。

　　多年来人们对体外净化自体骨髓中残留肿瘤细胞的效果一直持有争论，其主要原因是缺乏有效可靠的评估净化效果的检测手段。例如本组病例均系ANLL，用PCR定性或半定量方法来检测净化效果，由于各型ANLL尚缺乏通用的分子生物学基因标志，以及用PCR定性或半定量尚存在着假阳性、假阴性或敏感度问题，因此尚难具备实用性。用外源性耐新霉素标志基因在体外转入到造血干细胞内，待移植患者复发时来检测复发细胞是否来源于输入的外源性干细胞，目前条件尚不成熟。这样只有靠净化后患者长期存活率或净化与非净化两组随机对照比较来评定疗效，但后者临床上又很难做到。国外也采用非随机对比方法来评价净化效果，认为净化后移植长期无病存活率还是要比非净化者高^［7，8］。

　　总之，用净化方法行自体造血干细胞移植治疗白血病，无论在临床上或实验室仍有大量研究工作要做。■

　　基金项目：“九五”军队科研基金项目(96M137)；

　　作者简介：楼方定，男，1939-10-08生，浙江宁波人，汉族，1965年浙江医科大学毕业，解放军总医院血液科主任医师、教授，博士生导师，科室主任；发表论文56篇。电话：(010)939481

　　作者单位：楼方定（解放军总医院血液科，北京　100853）

　　　　　张伯龙（解放军总医院血液科，北京　100853）

　　　　　高春记（解放军总医院血液科，北京　100853）

　　　　　周绮（解放军总医院血液科，北京　100853）

　　　　　张苗（解放军总医院血液科，北京　100853）

　　　　　顾群（解放军总医院血液科，北京　100853）

　　　　　姚善谦（解放军总医院血液科，北京　100853）

　　　　　刘海川（解放军总医院血液科，北京　100853）

　　参考文献：

　　［1］高春纪，楼方定，刘海川等.癌光啉加光照体外对白血病细胞的杀伤作用［J］.中华血液学杂志，1994，15：370-373.

　　［2］楼方定，刘海川.骨髓移植后的近期并发症及其防治［J］.中华内科杂志，1993，32：479-483.

　　［3］Levy JG, Dowding C, Mitchell D et al. Selective elimination of malignant stem cells using photosensitigers followed by light treatment［J］. Stem Cells dayt, 1995,13:366-371.

　　［4］徐承勇，林　琳，黄夜萤等.用血卟啉衍生物及光照在体外净化骨髓中的癌细胞［J］.中国药理学报，1990，11：72-75.

　　［5］楼方定.稳步开展外周血干细胞移植工作［J］.中华血液学杂志，1996，17：505-507.

　　［6］刘海川，姚善谦，彭橘云等.自体造血干细胞移植治疗白血病及其他恶性肿瘤41 例临床研究［J］.中华内科杂志，1993，32：461-464.

　　［7］Gorin NG, Aegerter P, Auvert B et al. Autologous bone marrow transplantation for acute myelocytic leukemia in first remission: a European survey of the role of marrow purging［J］. Blood, 1990,75:1606-1610.

　　［8］Ball ED, Rybka WB. Autologous bone marrow transplantation for adult acute leukemia［J］. Hematol Oncol Clin North Am, 1993,7:201-204.