应用流式细胞术检测高转移人卵巢癌细胞多基因产物的表达

中华妇产科杂志 2000年第9期第35卷 论著摘要

作者：许沈华　冯建国　倪型灏　张谷

单位：许沈华（310022 杭州，浙江省肿瘤研究所）；冯建国（310022 杭州，浙江省肿瘤研究所）；倪型灏（310022 杭州，浙江省肿瘤研究所）；张谷（310022 杭州，浙江省肿瘤研究所）

　　肿瘤分子生物学研究证实，癌基因和抑癌基因在肿瘤的发生、发展中具有重要作用。我们已应用免疫组织化学方法对高转移人卵巢癌细胞系HO-8910PM和其母系HO-8910多基因表达进行研究^［1］。 现应用流式细胞术（FCM）观察11种基因产物在细胞的表达，应用FCM检测不但可以定性，而且可以进行定量分析，以探讨不同基因在卵巢癌发生、发展和转移中的作用及相关性。

　　一、 材料和方法

　　1.材料：高转移人卵巢癌细胞系HO-8910PM^［2］和人卵巢癌细胞系HO-8910^［3］均为我研究所建立。

　　2.试剂：实验用基因抗体产品和标记方法见表1。间接法所用第二抗体为兔抗鼠IgG-FITC (武汉生物制品公司产品)。对照用鼠IgG-FITC(B.D公司产品)和鼠IgG-PE（Coulter公司产品）。

表1　HO-8910 PM与HO-8910两株细胞系

　　FCM检测结果

　　3.方法：(1) 间接法：分别在每管加20 μl第一抗体和不加抗体的空白对照管，取HO-8910PM和HO-8910细胞悬液200 μl含10⁶细胞分别加入各管反应30 min，洗涤后，离心去上清液，各加第二抗体20 μl反应30 min，洗涤后，离心去上清液，各加固定液，进行检测。(2) 直接法：除不加第二抗体外，其余步骤同间接法。流式细胞仪（FACS Calibur，美国B-D公司产品）采集10 000个以上细胞。用Cell Guest软件直方图分析阳性标记细胞百分率。

　　二、结果

　　表1显示2株细胞系对9种基因产物均有强度不同的阳性表达。在高转移人卵巢癌细胞系HO-8910PM中， p21、Ki67、CyclinD1、PCNA、CD₄₄的表达均强于HO-8910(即母系)，而nm23、GSTπ的表达比母系弱。ER、PR在两株细胞系表达相似。CD25和MDR1在两株细胞系均呈阴性。

　　三、讨论

　　1．高转移细胞系细胞周期调控改变：快速增殖是恶性肿瘤的特征之一，肿瘤的生长速度取决于肿瘤组织中增殖细胞的多少及其分裂速度。而肿瘤细胞的生长、增殖和分裂与细胞周期的调控密切相关。细胞周期中有两个最基本的调控点，1个调控点位于G1期与S期的过渡时期，决定着是否进入细胞周期；另1个调控点位于G2期与M期之间，又叫G2/M过渡点，决定着细胞立即进入M期完成有丝分裂或是停滞一段时间。研究表明，一些基因及其产物如p21、Ki67、Cyclin D1、PCNA等是细胞周期调控中重要的调控因子。从表1可见，高转移细胞系^［2］p21、Ki67 、Cyclin D1 和PCNA 表达均比母系强。从核分裂指数看，高转移细胞系为44‰，而母系^［3］为27‰。 以上说明，高转移细胞系HO-8910PM细胞周期调控的变化比母系HO-8910更具有恶性细胞增殖的特征。

　　2．高转移细胞系的恶性程度增高：GSTπ是一种广泛分布的二聚酶，它是最典型最重要的胎盘性表达的同工酶。大量研究证明，GSTπ在许多人类恶性肿瘤中都有不同程度的表达，特别在癌前病变、不典型增生、化生和分化好的肿瘤中表达较高。如在正常肾组织中表达为100%，而在肾细胞癌组织中仅54%^［4］。在本研究中，高转移细胞系GSTπ表达比母系弱。该项指标也提示，HO-8910PM细胞比母系分化差，恶性度增高。

　　3．高转移细胞系侵袭和转移生长潜能增强：肿瘤细胞的浸润和转移受到多种相关基因或产物的调控。转移诱导基因表达增强和(或)转移抑制基因表达降低，是诱发肿瘤细胞转移表型改变而发生肿瘤转移的关键。应用特异的基因标记是揭示肿瘤转移机理的重要方法。CD₄₄基因的异常表达在肿瘤早期诊断、转移潜能判断、治疗和估计预后方面有很大潜在价值^［5］。在本研究中，高转移细胞系CD₄₄蛋白表达强于母系。nm23是抑制肿瘤细胞转移的基因，对肿瘤转移具有负调节作用。nm23基因在某些具有高转移的人类肿瘤组织中可出现表达下降、等位基因缺失及基因突变等3种形式的改变^［6］。在本研究中，高转移细胞系nm23基因产物表达比母系弱。以上两个指标说明，HO-8910PM较母系更具有转移生长潜能。

　　在耐药细胞中， MDR1基因产物——P-糖蛋白表达增加，表达程度与耐药程度成正比。在本研究中，两株细胞系均呈阴性。说明两株细胞均不是耐药细胞系。 CD25 是活化T细胞标志。在本研究中，观察两株细胞上是否有膜白细胞介素2受体存在，结果证明两株细胞系均呈阴性。

　　通过用FCM对高转移人卵巢癌细胞HO-8910PM和其母系HO-8910多基因产物的表达检测和对比研究再一次证明，HO-8910PM是一株较母系HO-8910分化更差、恶性程度更高、更具恶性细胞增殖特征和更具侵袭和转移生长潜能的细胞株。同时也证实，肿瘤的发生、浸润和转移是多基因参与、多阶段协同作用的结果。

　　本课题受浙江省自然科学基金资助(基金编号：396410)

参考文献

　　1，倪型灏, 许沈华, 张谷，等. 高转移人卵巢癌细胞系HO-8910PM和其母系多基因表达研究. 实用癌症杂志, 1999,14:18-20.

　　2，Shenhua X, Lijuan Q, Hanzhou M， et al. Establishment of a highly metastatic human ovarian cancer cell line (HO-8910PM) and its characterization. J Exp Clin Cancer Res, 1999,18:233-239.

　　3，牟瀚舟,许沈华,张奕荫，等. 人卵巢癌细胞HO-8910的建立及其生物学特性. 中华妇产科杂志, 1994,29:162-164.

　　4，施作霖，陈冰，陈梓甫，等. P糖蛋白和谷胱甘肽-S-转移酶在肾细胞癌中的表达. 临床与实验病理学杂志，1998，14：131-133.

　　5，李学彦. CD₄₄与消化道肿瘤及转移的关系. 中华消化杂志,1999,19:196-197.

　　6，吴小华. 癌基因与肿瘤转移. 中国癌症杂志,1996,6:209-213.

(收稿日期：1999-11-03)