流感嗜血杆菌下呼吸道感染的实验和临床研究
中华结核和呼吸感染 1999年第4期第22卷 论 著
作者：方正 罗文侗 修清玉 赖国祥
单位：200003 上海，第二军医大学长征医院呼吸科
关键词： 流感嗜血杆菌；培养基；呼吸道感染
【摘要】 目的 探讨提高流感嗜血杆菌(Hi)分离率的方法，调查Hi下呼吸道感染的临床特点及对抗生素的敏感性。方法 比较改良哥伦比亚巧克力琼脂(ICCA)与血琼脂加金黄色葡萄球菌划线(BASS)对Hi的分离率；以Kribry-Bauer(KB)法测定Hi对20种抗生素的敏感性，以肉汤微量稀释法测定12种抗生素对Hi的最小抑菌浓度（MIC）；分析92例Hi下呼吸道感染的临床特点。结果 ICCA的分离率为20％，与BASS法(13%)比较，差异有显著性(P＜0.01)；第三代头孢菌素和喹诺酮类抗生素抗菌活性高，氨苄西林的耐药率为21％，而第一代头孢菌素耐药率达45%～49％；92例下呼吸道感染患者中67例(73%)临床上以支气管肺炎为主要表现。结论 ICCA可提高Hi的分离率；Hi下呼吸道感染临床表现无特异性，但对Hi耐药有增加趋势。
Laboratory and clinical investigation on lower respiratory tract infection by Haemophilus influenzae
FANG Zheng, LUO Wentong, XIU Qingyu,et al.Department of Respiratory Medicine, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003
【Abstract】 Objective To improve the positive rate of Hi isolation and to study the epidemiology, antibiotic sensitivity and clinical characteristics of the lower respiratory tract infection by Hi.Methods Modified Columbia chocolate agar(ICCA) was compared with blood agar staphy stick (BASS) for the primary isolation of Hi from sputa. The sensitivities of 20 antibiotics to Hi were determined in vitro by KB method and MICs of 12 antibiotics were determined by broth microdilution method. The clinical characteristics of 92 cases with lower respiratory tract infection by Hi were analyzed.Results The isolation rate of Hi by ICCA was 20%,which was higher than 13% of BASS（P＜0.01）. The third generation cephalosporins and the quinolones were most active against Hi. The resistant rate against Hi of ampicillin was 21%, however, that of the third generation cephalosporins was 45%～49%. 67(73%) of 92 cases were bronchopneumonia.Conclusions The isolation rate of Hi could be improved by ICCA. The clinical characteristic of lower respiratory tract infection by Hi was not specific. There has been a steady increase of antibiotic resistance during these years.
【Key words】 Haemophilus influenzae Culture medium Respiratory tract infection
流感嗜血杆菌(Hi)是引起急性下呼吸道感染最常见的致病菌之一。Hi的生长需要V因子和X因子，故临床上对其检出率较低。近年国外Hi感染发病率呈增加趋势，且耐药率及耐药范围也有所增加，为此我们根据国内、外经验，研制了改良哥伦比亚巧克力培养基，并分析了92例Hi下呼吸道感染的临床特点及耐药情况。
资料与方法
一、培养基
1.改良哥伦比亚巧克力琼脂(ICCA)：以Colubia琼脂为基础，加2%胰蛋白胨，1%酵母浸出粉，溶于1 000 ml蒸馏水中，调整pH值至7.4～7.6，高压灭菌后冷却至85℃，加入5%脱纤维羊血制成平板。
2.血琼脂(BA)。
3.嗜血杆菌实验(HTM)后二种培养基均按常规方法制备。
二、方法
1.取下呼吸道感染患者合格痰标本中心部分划线接种于ICCA和BA培养基上，其中在ICCA的第二区以倒三角形贴上万古霉素Ⅴ(30 μg)，杆菌肽B(10 IU)及克林霉素C(2 μg)，间距1.5～2 cm，简称ICCA-VBC，BA平板以金黄色葡萄球菌交叉划线接种(BASS)，置5% CO2，37℃培养24小时，挑取可疑菌落鉴定。
2.Kirby-Bauer(KB)法：用灭菌生理盐水将待测菌调整成0.5麦氏（McFarland）管浓度，均匀涂布于HTM培养基上，贴药敏纸片，培养24小时后量取抑菌圈直径。
3.肉汤微量稀释法:用灭菌生理盐水将待测菌调成(1.5～3.0)×10-7菌落形成单位(cfu)/ml(目测硫酸钡比浊法)，再以HTM肉汤稀释100倍，至105 cfu/ml，将该菌液加入快速定量细菌药敏测试板(中国托普生物技术公司，宁波)，同条件培养后，用微量酶标仪或目测比浊。
三、病例选择
1995～1997年我院门、急诊和住院拟诊为下呼吸道感染的患者，并具备以下条件：
1.有发热、咳嗽、咳痰或肺部湿音等肺部感染的症状和体征。
2.痰涂片镜检有较多的中性粒细胞(白细胞∶上皮细胞＞2.5)，且可见革兰阴性短小杆菌，痰培养连续2～3次以上见Hi优势生长。
3.肺部X线检查有浸润性炎性病灶或肺纹理增多。
结 果
收集我院下呼吸道感染患者合格痰标本1 482份(住院患者1 034份，门、急诊患者448份)，分离出Hi 165株，确诊为Hi感染的92例。
在对门、急诊448份痰标本中，用ICCA培养基分离出90株Hi，其分离率为20%(90/448)，在该培养基3种药敏纸片形成的三角形区域内，Hi菌落较大易辨别，而其它细菌少或无，用BASS培养基分离出56株Hi，分离率为13%(56/448)，经χ2检验，ICCA分离率明显高于BASS培养基(χ2=10.515，P＜0.01)。
92例患者中分离的Hi对抗生素的敏感性测定结果见表1，2，两种方法测定结果基本相符。
表1 92株流感嗜血杆菌对20种抗生素敏感性的测定结果
| 抗生素 |
耐药 |
敏感 |
| 菌株数 |
耐药率(%) |
菌株数 |
敏感率(%) |
| 头孢拉定 |
49 |
53 |
43 |
47 |
| 头孢唑啉 |
45 |
49 |
47 |
51 |
| 头孢克罗 |
8 |
9 |
84 |
91 |
| 头孢呋辛 |
9 |
10 |
83 |
90 |
| 头孢噻肟 |
3 |
3 |
89 |
97 |
| 头孢哌酮 |
0 |
0 |
92 |
100 |
| 头孢曲松 |
0 |
0 |
92 |
100 |
| 环丙沙星 |
0 |
0 |
92 |
100 |
| 氧氟沙星 |
0 |
0 |
92 |
100 |
| 庆大霉素 |
14 |
15 |
78 |
85 |
| 阿米卡星 |
10 |
11 |
82 |
89 |
| 妥布霉素 |
8 |
9 |
84 |
91 |
| 复方磺胺甲噁唑 |
18 |
20 |
74 |
80 |
| 氯霉素 |
4 |
4 |
88 |
96 |
| 红霉素 |
25 |
27 |
67 |
73 |
| 乙酰螺旋霉素 |
38 |
41 |
54 |
59 |
| 米诺环素 |
7 |
8 |
85 |
92 |
| 氨苄西林 |
19 |
21 |
73 |
79 |
| 舒他西林 |
9 |
10 |
83 |
90 |
| 哌拉西林 |
5 |
5 |
87 |
95 |
表2 12种抗生素对92株流感嗜血杆菌的MIC比较
| 抗生素 |
MIC(μg/ml) |
| 范围 |
50% |
90% |
| 环丙沙星 |
≤0.13～1 |
0.3 |
0.5 |
| 庆大霉素 |
≤0.25～＞16 |
2.0 |
＞16.0 |
| 妥布霉素 |
≤0.25～＞16 |
2.0 |
8.0 |
| 阿米卡星 |
≤0.5～＞32 |
4.0 |
＞32.0 |
| 氯霉素 |
≤0.25～＞32 |
2.0 |
8.0 |
| 氨苄西林 |
≤0.5～＞32 |
2.0 |
＞32.0 |
| 哌拉西林 |
≤0.5～＞64 |
1.0 |
8.0 |
| 头孢唑啉 |
≤0.5～＞64 |
8.0 |
＞64.0 |
| 头孢噻肟 |
≤0.5～＞64 |
2.0 |
8.0 |
| 头孢哌酮 |
≤0.5～1 |
≤0.5 |
2.0 |
| 头孢他啶 |
≤0.5～1 |
≤0.5 |
1.0 |
| 头孢曲松 |
≤0.5～1 |
≤0.5 |
1.0 |
本组92例患者中男64例，女28例，发病年龄为14～82岁，≤19岁占12%，20～39岁占20%、40～59岁占23%，≥60岁占46%。92例患者吸烟与不吸烟的比例为0.92∶1；按性别分层后，男性中吸烟与不吸烟的比例为2.04∶1。全年均有病例发生，其中10～3月份发病68例占74％。
有基础肺疾病者65例(71％)，主要为慢性阻塞性肺疾病(COPD)者39例，其次为支气管扩张症11例、肺部肿瘤8例、支气管哮喘4例、肺结核3例。其它基础疾病8例(肝硬化3例、糖尿病2例和白血病3例)。临床表现为：发热51例，体温＜38.5℃ 29例，＞38.5℃ 22例，10例伴有寒战。本组均有不同程度的咳嗽、咳痰，其中咳黄脓痰53例，血痰10例，气急14例，胸痛8例，可闻湿音48例。胸部X线表现为支气管肺炎67例，大叶性肺炎9例和肺纹理增多16例；外周血白细胞总数在(3.2～19.3)×109/L，其中＞10×109/L和(或)中性粒细胞＞80％者62例 ；混合菌感染7例，经抗生素等治疗后，84例痰菌转阴，5例替换，Hi清除率为97％。3例死亡(呼吸衰竭2例、肺癌1例)，病死率为3％。
讨 论
Hi的生长条件较特殊,需V因子和X因子参与。传统的Hi分离是用巧克力琼脂，但由于大量杂菌的生长，影响了分离率。根据Chapain等［1］和Rennie等［2］研究结果，本组实验采用Columbia琼脂、5％羊血和酵母浸出粉，并加3种药敏纸片，即ICCA-VBC，它分离率高、具有选择性、生长的菌落易辨别、易于制备、保存稳定且价格便宜，适合在普通实验室推广应用。为提高Hi的分离率,除要选择适当的培养基外，应尽量在应用抗生素之前采集标本，并应重视痰标本的采集质量、送检和接种的正确方法。
近年来，Hi对氨苄西林的耐药率逐年增加［3，4］，国外耐药率从1%～64％不等［5］。在我国氨苄西林常作为第一线抗生素应用于临床，用量大，应用时间长，因此耐药率增长较快。本组研究发现，Hi对氨苄西林的耐药率为21％，而且耐药范围也有扩大，除喹诺酮类抗生素外，其它抗生素均有不同程度的耐药，与Jorgersen［6］1992年对美国的耐药情况调查相似。近两年国外已有喹诺酮类抗生素耐药的个案报道［7］。本组实验结果显示：喹诺酮类、第三代头孢菌素、哌拉西林和氯霉素等抗生素抗菌活性高；第二代头孢菌素和氨基糖苷类等抗生素敏感性也较高；第一代头孢菌素敏感性相对较差。
Hi是呼吸道感染中重要的致病菌之一。据国外调查［8］，在细菌性肺炎各种病原中Hi占5%～19％,而在COPD急性加重的病因中43％是Hi。我们研究发现［9］，我院下呼吸道感染的病因中Hi占14％。在COPD患者中Hi的检出率也较高，应引起足够的重视。研究表明，Hi下呼吸道感染多见于老年男性，其中有吸烟史者易感染，虽一年四季均有发病，但以秋冬季多见。
本组病例大部分有慢性肺部基础疾病，其中以COPD最常见，国外也有类似报道［7］。本病临床和X线无特异性，支气管肺炎表现相对较多，其中病死率为3％，比文献报道［10，11］的7%～33％低，此与原发病的严重程度有关，绝大部分病例(97％)经抗炎等对症治疗可治愈或好转。本病临床表现无特异性，对有慢性肺疾病基础的老年患者出现感染征象时，应考虑到该菌感染的可能，及时行病原学检查，如能早期诊治，其预后较好。
参考文献
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10 Levin DC, Schwarz MI, Matthay RA, et al. Bacteremic haemophilus influenzae pneumonia in adults. Am J Med,1977,62:219-224.
11 Farley MM,Stephens DS,Brachman PS, et al. Invasive haemophilus influenzae disease in adults. A prospective, population-based surveillance. Ann Intern Med, 1992,116:806-812.
(收稿：1998-09-24 修回：1998-12-28)
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