喘康平合剂对感染副流感病毒3型豚鼠气道反应性和气道炎症的影响

广州中医药大学学报 2000年第3期第17卷 实验研究

作者：许银姬　张迪　林琳

单位：许银姬　林琳（广州中医药大学第二附属医院内三科，广州　510120）；张迪（黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨　150040）

关键词：哮喘/中药疗法；@喘康平/药理学；瓜蒌薤白半夏汤/药理学；副流感病毒3型；P物质；@气道反应性；疾病模型，动物；豚鼠

　　摘要：目的：探讨病毒感染与哮喘气道高反应性(AHR)的关系及喘康平合剂对 AHR 的影响。方法：致敏豚鼠感染副流感病毒 3 型(P-3)后，对其进行气道反应性测定、支气管肺泡灌洗液(BALF)中各种细胞计数及 BALF 中 P 物质含量测定。结果：致敏豚鼠接种 P-3 后，与对照组比较，气道反应性明显增高(P＜0.01)，BALF 中巨噬细胞和嗜酸性细胞明显增多(P＜0.01)，P 物质含量增多(P＜0.05)；预先给予喘康平合剂，则以上病理变化明显减轻(P＜0.05)。结论：P-3 病毒感染能引起豚鼠 AHR 及气道炎症，喘康平合剂对其有治疗作用。

　　中图分类号：R511.7　　　文献标识码：A

　　文章编号：1007-3213(2000)03-0256-04

Effect of Chuankangping Mixture on Airway Responsiveness and

　　Virus 3

XU Yinji，LIN Lin

　　（The Second Affiliated Hospital, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510120, China）

　　ZHANG Di

　　（The First Affiliated Hospital, Heilongjiang University of TCM, Haerbin 150040, China）

　　Abstract: The relationship between virus infection and airway hyperresponsiveness (AHR) in guinea pigs with asthma and the effect of Chuankangping Mixture (CM) on AHR were investigated. The asthmatic guinea pigs were established with intraperitoneal injection of ovalbumin. The asthmatic guinea pigs without infection and medication served as control. Airway responsiveness and the number of various cells and substance P in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were measured. The results showed that in the asthmatic guinea pigs infected with parainfluenza virus 3, airway responsiveness became stronger (P＜0.01), the number of macrophages and eosinophils in BALF increased (P＜0.01), and substance P content elevated (P＜0.05) as compared with control. The above pathologic changes became obviously reduced in the asthmatic guinea pigs pretreated with CM (P＜0.05). It is indicated that parainfluenza virus 3 infection can lead to airway inflammation and AHR in guinea pigs, and CM exerts a protective effect against the pathological changes.

　　Key words: ASTHMA/TCD ther.;　@CHUANKANGPING/pharmacology;

　　GUALOU XIEBAI BANXIA DECOCTION/pharmacology;

　　PARA-INFLUENZA VIRUS TYPE 3;　SUBSTANCE P;

　　@AIRWAY RESPONSIVENESS;　DISEASE MODELS, ANIMAL;　GUINEA PIGS

　　10多年前人们就已经注意到病毒性上呼吸道感染可引起支气管反应性暂时升高，一般可持续6～8周^［1］。近年来的研究也表明，呼吸道病毒感染不仅是重要的哮喘诱发因素，而且在气道高反应性和哮喘的发病机理中起重要作用。目前研究呼吸道病毒感染诱发哮喘的机制也主要观察气道高反应性。我们根据Buckner方法^［2］建立了用副流感病毒3型(P-3)感染豚鼠引起气道反应性增高的动物模型，旨在探讨病毒感染引起气道高反应性(AHR)和气道炎症的机制及喘康平合剂对AHR和气道炎症的治疗作用。

　　1　材料与方法

　　1.1　主要药品和试剂　P物质放免试剂盒，上海科锐生物技术中心提供；副流感病毒3型由哈医大二院病毒室提供；Hep-2细胞由黑龙江省防疫站提供；麻杏石甘汤(麻黄、杏仁、甘草、石膏等组成)、喘康平合剂(瓜蒌、薤白、半夏、黄芩、麻黄、白果等组成，其生药含量为1kg/L)，均由黑龙江中医药大学附属第一医院药剂科提供；强的松由天津制药三厂生产。

　　1.2　实验动物和分组　选健康豚鼠40只，体重(250±50)g，雌雄各半，均由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。共分5组，每组8只。A组，卵白蛋白(OA)致敏后未感染P-3，作为对照组；B组，根据Buckner法^［2］，豚鼠在OA致敏后感染副流感病毒3型(P-3)，作为模型组；C组，感染P-3前1d起灌胃给药强的松1.4　mg/kg，连续5　d，作为强的松组；D组，感染P-3前1d起灌胃给药喘康平合剂15mL/kg，连续5d，作为喘康平组；E组，感染P-3前1d起灌胃给药麻杏石甘汤6.5　g/kg，连续5d，作为麻杏组。

　　1.3　模型建立　参照Buckner^［2］方法，豚鼠在1、3、5d腹腔注射卵白蛋白(OA)10mg/kg，在最后1次注射后的21d，开始用下述方法接种病毒培养液。副流感病毒3型(P-3)于33℃条件下在人表皮样癌细胞(Hep-2细胞)中培养3～5d后，将感染细胞制成细胞碎片，2000r/min离心30min，制成澄清悬浮液，测定每0.1mL人子宫颈癌传代细胞(Hela)的半数组织培养感染量为10⁵～10^6.5。除对照组外，其余豚鼠在轻度乙醚麻醉下以鼻吸入法接种病毒悬浮液0.2～0.4　mL。对照组豚鼠接种与病毒悬浮液制作方法相同的未感染病毒的细胞培养液。接种程序是每只豚鼠接种2次，间隔60min。感染和未感染的豚鼠放在不同的房间并于第4天开始作下面实验。

　　1.4　气道反应性测定　用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉豚鼠，然后气管切开、插管，连接动物呼吸器，气道反应性测定按照王长征方法^［3］进行。

　　1.5　支气管肺泡灌洗(BAL)　通过气管插管推注静脉注射用生理盐水5mL，每次注入后，随即负压吸引，共灌洗6次，总量30mL。支气管肺泡灌洗液(BALF)用单层纱布过滤后，离心300g，4℃，10min，分离细胞和上清液，上清液分装在-20℃冻存，供测定P物质用。去除上清液后所得的细胞团充分振散，即涂片、吹干，用Wright染色，在油镜下计数200个细胞作分类，计算出各种细胞成分的百分数和绝对数。

　　1.6　BALF上清液P物质测定　BALF上清液的提取和加样均严格按说明书进行，然后混匀，4℃24h。每管加免疫沉淀500μL，混匀，室温放置15min，离心3000r/min15min，弃上清，沉淀部分用5302型γ自动计数仪(美国PAKARD公司生产)计数。根据所建立的标准曲线算出待测样本P物质含量(ng/L)。

　　2　结果

　　2.1　P-3感染对气道反应性的影响　见图1。模型组与对照组比较，气道反应性增高，差异有显著性(P＜0.01)；强的松组、喘康平组分别与模型组比较，气道反应性均降低，差异有显著性(P＜0.01)，麻杏组与模型组比较，差异无显著性(P＞0.05)；喘康平组与强的松组比较，差异无显著性(P＞0.05)，与麻杏组比较差异有显著性(P＜0.05)。

图1　P-3感染对气道反应性的影响

　　A：对照组，B：模型组，C：强的松组，D：喘康平组，E：麻杏组。经方差齐性检验，各组方差相等(F=3.2777)，采用q检验(Newman_keuls法)

表1　BALF中细胞分类(±s)

　　MC：肺泡巨噬细胞，LC：淋巴细胞，NC：中性粒细胞，EC：嗜酸性细胞；经方差齐性检验，F(细胞总数)=3.2777，F(MC)=3.4753，F(LC)=1.0349，F(NC)=2.0254，各组方差相等，采用q检验(Newman_keuls法)；F(EC)=19.1557，各组方差不齐，采用秩和检验(Wilcoxon法)2.2　P-3感染后BALF中各种细胞的变化　见表1。模型组与正常组比较，BALF中细胞总数增多(P＜0.05)，同时肺泡巨噬细胞(MC)增多(P＜0.05)，嗜酸性细胞(EC)明显增多(P＜0.01)，其他细胞变化不明显(P＞0.05)；喘康平组、强的松组、麻杏组分别与模型组比较，BALF中细胞总数、MC、淋巴细胞(LC)、中性粒细胞(NC)差异无显著性(P＞0.05)，EC差异有显著性(P＜0.01)，且喘康平组与强的松组、麻杏组比较，差异均有显著性(P＜0.01)。

　　2.3　P-3感染后BALF中P物质的变化　见表2。

　　2.4　模型组BALF中P物质含量与气道反应性的相关性分析　如图2所示，豚鼠P-3感染后其气道反应性升高，BALF中P物质含量亦增加，二者呈显著正相关(P＜0.01)。

　　2.5　喘康平组BALF中P物质含量与气道反应性的相关性分析　如图3所示，与模型组比较，喘康平组BALF中P物质含量下降(P＜0.05)，气道反应性亦下降(P＜0.05)，二者呈显著正相关(P＜0.05)。

表2　BALF中P物质含量(ρ_P，BALF)的变化(±s)

　　经方差齐性检验，各组方差相等(F=7.9866)，采用q检验(Newman_keuls法)。**与模型组比，P＜0.01；△△与正常组比，P＜0.01；▲与麻杏组比P＜0.05

图2　模型组BALF中P物质与气道反应性散点图

图3　喘康平组BALF中P物质含量

　　与气道反应性散点图

　　3　讨论

　　哮喘是由多种炎症细胞、炎症介质和细胞因子参与的慢性气道非特异性炎症，表现为气道反应性增高。近年来，随着病毒检测技术的不断提高和科研工作的深入开展，呼吸道病毒感染被认为是哮喘发病的可能病因之一。早期的流行病学调查表明，呼吸道病毒感染会使哮喘加重，儿童更为明显。Saban等^［4］在体外也观察到副流感病毒感染的豚鼠离体气道平滑肌对神经肽P物质收缩反应增强。

　　本实验在豚鼠致敏的基础上接种P-3，发现其气道反应性明显增高，其BALF中以巨噬细胞和嗜酸性细胞增多为主，其他细胞成份变化不明显，同时BALF中P物质含量明显增加。病毒感染的气道炎症常与免疫反应同时发生，这些免疫反应也同时引起气道上皮损伤和炎症反应。气道上皮损伤造成细胞通透性增大，使某些大分子物质及抗原易通过上皮细胞与粘膜下肥大细胞相接触，使之致敏释放多种炎症介质；还可以使正常气道上皮的保护作用丧失，使粘膜下感觉神经末梢暴露。吸入的变应原和化学物质因而可能直接到达粘膜下层，并通过轴突反射引起平滑肌痉挛，加重气道炎症。最近的研究表明，肺内自主神经系统除肾上腺素能、胆碱能神经系统，还存在非肾上腺素能、非胆碱能(NANC)神经系统，P物质即是NANC的神经递质。Sterk^［5］认为病毒感染可增加缓激肽释放，兴奋C-纤维即轴突反射，从而释放前炎症感觉神经肽-神经激肽A、P物质和降钙素基因相关肽(CGRP)。体外实验表明，P物质对呼吸道平滑肌有很强的收缩作用^［6～8］，粘液过量分泌、支气管水肿和血管外渗^［9］等病理变化，都有可能增加介质的释放和炎性细胞浸润，并呈明显剂量依赖性。Crimi等^［10］将P物质水溶液喷雾至非发作期的哮喘病人上呼吸道，结果引起很强的支气管痉挛。在人体离体气管实验中也得到了与在体实验相同的结果。

　　本实验结果还表明，喘康平合剂和强的松能通过减少嗜酸性细胞的集聚和神经肽P物质的释放而降低病毒感染引起的气道反应性增高。喘康平合剂为瓜蒌薤白半夏汤加麻黄、白果、黄芩等组成，其功效为通阳泄浊，降逆平喘。前期动物实验研究已经证实，喘康平合剂具有平喘、抗炎、止咳、祛痰的功效；同时，临床观察表明其能有效地抑制哮喘发作(曲秀娟.喘康平合剂防治支气管哮喘的实验研究.黑龙江中医药大学硕士学位论文.1996)。现代药理学研究表明，薤白有良好的平喘作用，机理可能与其改善肺通气功能，尤其是小气道通气功能，提高PGI₂含量，抑制TXA₂的生成，降低脂化脂质及抗自由基效应有关^［11］。黄芩具有抑制炎性介质释放，抗变应性炎症，双向调节免疫功能作用^［12］。有报道地塞米松能使内源性膜金属内肽酶活性增加，并抑制P物质受体mRNA合成^［13］，糖皮质激素在治疗哮喘中的这一作用提示喘康平合剂抑制P物质方面与强的松可能有着相似的作用，其抑制病毒感染引起的气道高反应性和气道炎症作用可能与此相关，其详细的作用机制还有待于进一步研究。

　　基金项目：黑龙江省卫生厅资助项目(编号：97070)

　　作者简介：许银姬(1971-)，女，硕士研究生，住院医师

　　参考文献：

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收稿日期：1999-09-20