补肾益智方对老年性痴呆大鼠学习记忆能力保护作用的观察

广州中医药大学学报 2000年第2期第17卷 老年性痴呆防治研究

作者：赖世隆　胡镜清　王奇　温泽淮　梁伟雄

单位：广州中医药大学老年脑病研究所，广州　510405

关键词：痴呆；老年性；中药疗法；阿尔茨海默病；中药疗法；记忆障碍；中药疗法；补肾药；治疗应用；@补肾益智方；药理学；疾病模型；动物；大鼠

　　摘要：为寻求防治老年性痴呆的有效措施，运用Morris水迷宫评价了中药补肾益智方(由蛇床子、枸杞子、女贞子、人参等组成)对由D_半乳糖致亚急性衰老加上Meynert核损毁所致阿尔茨海默病模型大鼠的学习记忆能力的保护作用。结果表明：补肾益智方能够改善模型大鼠的学习记忆成绩，包括缩短模型大鼠在Morris水迷宫中寻找到平台的逃避潜伏期(P＜0.01)，延长其在原平台象限游泳的距离(P＜0.05)。提示补肾益智方对阿尔茨海默病模型大鼠的学习记忆能力有一定的保护作用。

　　中图分类号：R749.1⁺6　　　文献标识码：A

　　老年性痴呆(又称阿尔茨海默病，Alzheimer's disease,AD)已成为严重危害老年人健康和影响其生活质量的主要疾病之一，但目前仍缺乏有效的防治药物和方法。为此，我们应用 Morris 水迷宫评价了自制的补肾益智方对由 D_ 半乳糖致亚急性衰老加上鹅膏蕈氨酸(Ibotenic acid,IBO)损毁脑 Meynert 基底核所致的 AD 大鼠模型的学习记忆能力的保护作用。

　　1　材料与方法

　　1.1　药物与试剂

　　补肾益智方由蛇床子、枸杞子、女贞子、人参等中药组成，制成浓缩液。双益平片购自上海红旗制药厂(批号为 970101)，每片含石杉碱甲(Huperzine_A)0.05mg。D_ 半乳糖为上海试剂二厂出产，IBO 购自 Sigma 公司，均为分析纯。

　　1.2　动物分组、造模与给药

　　15 月龄初老年雌性 Wistar 大鼠 48 只，体重 300～450 g，均由第一军医大学实验动物中心提供。常规分笼饲养，自然照明，随意饮水和取食。随机分成 4 组，每组 12 只：其中初老年正常对照组(简称正常组)，腹腔注射生理盐水 6 周及脑内 Meynert 核注射生理盐水；AD 模型组(简称模型组)，腹腔注射 D_ 半乳糖(48 mg·kg^-1.d^-1)6 周和脑内双侧 Meynert 核注射 IBO；双益平片观察组(简称双益平组)和补肾益智方观察组(简称补肾方组)，造模均同模型组，但在腹腔注射半乳糖(6 周)同时分别给予双益平片(0.3 mg·kg^-1.d^-1)或补肾益智方浓缩液(相当生药量 6 g·kg^-1.d^-1)灌胃。脑内注射在腹腔注射后参考有关文献进行^［1］。造模结束后，正常组、模型组、双益平片组和补肾方组分别存活 9 只、8 只、7 只和 9 只。

　　1.3　Morris 水迷宫及检测

　　所有大鼠在脑内注射后进行 Morris 水迷宫测试。Morris 水迷宫(Morris water maze,MWM)参照有关文献制作^［2］。为一不锈钢的圆形水池，直径 200 cm，高 50 cm，水深 30 cm，水温控制在(26±1)℃。池壁标明 4 个入水点，由此将水池等分为 4 个象限，任选其中 1 个象限，正中放置 1 个直径 11 cm、高 29 cm 的平台。迷宫上方安有摄像机，并和录像机以及显示器连接，自动录入大鼠游泳轨迹进行分析。测试程序包括：(1)定位航行试验(place navigation)：历时 5 d，每天上下午各 4 次，将大鼠面向池壁分别从 4 个入水点放入水中，记录其在 2 min 内寻找到平台的时间(逃避潜伏期，escape latency)。如果大鼠在 2 min 未找到平台，则由实验者用手牵引其至平台上，让大鼠停留 10 s，再放回笼中。(2)空间探索试验(spatial probe)：第 6 天撤除平台，将大鼠任选 1 个入水点放入水中，记录其 2 min 的游泳轨迹，分别计算其跨越各象限内的游泳距离以及在原平台象限游泳的时间和距离占整个游泳时间和距离的百分比。

　　1.4　统计方法

　　采用 SAS6.12 统计软件包分析。其中单因素方差分析，根据方差齐性检验结果，分别采用 Newman_Keuls 法或 Scheffe 法。多因素重复测量方差分析采用 Huynh_feldt 法。显著性水平取 α=0.05。

　　2　结果

　　2.1　大鼠逃避潜伏期的总体变化

　　图 1 是各组大鼠在历时 5 d 40 次定位航行试验中日平均逃避潜伏期的变化。从中可以看到，4 组大鼠均随着训练天数增加，逃避潜伏期越来越短，表明各组大鼠在历次学习训练中均已逐渐学习寻找平台。但学习记忆过程存有明显差异。经以测得的大鼠每次逃避潜伏期作为观察值，以组别、测试天数作为效应因子(effective factor)对各组大鼠的总体逃避潜伏期变化进行多因素重复测量统计分析^［3］，结果表明各组间逃避潜伏期 5 d 的总体变化具有显著性差异(P＜0.01)。两两比较发现：模型组的逃避潜伏期较正常组明显延长，差异有显著性(P＜0.001)。补肾益智方组分别与模型组、双益平组比较，其逃避潜伏期显著缩短(均 P＜0.001)，但同时其逃避潜伏期仍较正常组显著延长(P＜0.001)。双益平组与模型组比较，差异则无显著性(P＞0.05)，与正常组比较有显著性差异(P＜0.001)。

　　2.2　大鼠空间探索所反映记忆能力的变化

　　表 1 为各组大鼠撤除平台后 2 min 在各象限游泳的距离(R、P、L、O 分别代表大鼠在原平台右侧象限、原平台象限、原平台左侧象限和原平台对侧象限)。经单因素方差分析，正常组大鼠各象限游泳距离的差异有显著性(P＜0.001)，补肾方组大鼠各象限游泳距离之间的差异亦有显著意义(P＜0.05)，而模型组、双益平组大鼠各象限游泳距离差异无显著性(P＞0.05)。表明正常组和补肾方组大鼠对原平台象限的记忆较模型组和双益平组好。

图 1　各组大鼠 5 d 逃避潜伏期动态变化

表 1　大鼠空间探索试验结果(±s)

　　#与正常组比较 P＜0.05，## P＜0.01；△组内各象限游泳距离比较 P＜0.05，△△ P＜0.01　　同时我们检测了各组大鼠在原平台象限(P)游泳的时间(t_P)和距离(l_P)与总游泳时间(t_T)和总距离(l_T)之比p₁(t_P/t_T)和p₂(l_P/l_T)。经单因素方差分析，上述 4 组之间的时间比和距离比比较，差异均有高度显著性(P＜0.01)。两两比较结果显示：模型组、双益平组原平台象限游泳的时间比和距离比分别与正常组比较，差异均有显著性(均 P＜0.01)，二者之间比较无显著性差异(均 P＞0.05)。补肾方组原平台象限游泳的时间比和距离比分别与模型组和双益平组比较，差异不显著(均 P＞0.05)，但有增加的趋势。

　　3　讨论

　　缺乏有效的防治方法是当前 AD 研究中亟待解决的主要问题之一。目前在临床上已经使用的 AD 治疗药物主要包括胆碱酯酶抑制剂、钙阻滞剂和神经营养剂等，但疗效均不能令人满意。如美国 FDA(Food and Drug Administration)已批准临床用于治疗 AD 的 Tacrine(他克林)、Aricept(安理申)均仅能改善部分认知障碍的症状，且肝脏毒性等副作用较大^［4，5］。发挥中医特色，寻求治疗 AD 的有效中药有十分重要的意义。国内外已有许多学者就此进行了研究，初步结果提示补肾、调心等方药对实验性 AD 模型鼠学习记忆能力有一定的改善作用^［6～8］。但在既往的研究中常常存在模型不甚理想、学习记忆行为评价不够科学客观以及统计分析方法不当等问题。补肾益智方针对 AD 肾精不足、气血亏虚的病机设计组方，全方具补肾填精、益气养血、开窍醒神之功效，临床试用于痴呆已显示了初步的疗效。为进一步明确补肾益智方对 AD 学习记忆的作用，本研究在 AD 动物模型、学习记忆检测以及统计学分析等方面作了较大的改进。在总结以前 AD 动物模型研究成果的基础上，设计了 D_ 半乳糖致亚急性衰老合并 Meynert 核损毁的多因素复合实验性 AD 大鼠模型，即在国内外认可和广泛使用的 D_ 半乳糖致亚急性衰老模型提供一个老化背景的基础上，再以 IBO 损毁 Meynert 核模拟 AD 的胆碱能神经功能缺失。我们的前期研究工作已表明，此模型大鼠表现为空间学习记忆能力显著下降，大脑皮质广泛区域 AChE 阳性神经纤维密度均较正常对照组显著减低，提示该复合模型较以前的单因素 AD 动物模型更贴近 AD 复杂的临床病理变化过程^［1，9］。同时，我们还认为，由于中药作用的多环节性，复合的 AD 模型可能更适合用作筛选防治 AD 有效中药的研究。另外，我们选用了近年发展较快、能够较好地评价实验动物空间学习记忆能力的 Morris 水迷宫测试系统，应用了包括多因素重复测量数据在内的统计分析方法，提高了研究结果的客观性和科学性。

　　上述研究结果提示，D_ 半乳糖加速衰老加上 Meynert 核损毁的 AD 模型组大鼠在 Morris 水迷宫中平均逃避潜伏期明显延长、原平台象限游泳的时间和距离显著缩短，表明模型组大鼠学习记忆能力严重受损。而补肾方组大鼠逃避潜伏期较模型组和对照组缩短，以及原平台象限游泳的距离和时间延长。提示补肾益智方对本实验 AD 模型鼠的学习记忆能力有优于对照药的保护作用。另一方面，补肾方组大鼠与正常组在 Morris 水迷宫测试中存在的差异，似乎提示补肾益智方尚无法完全保护 D_ 半乳糖和 IBO 所致的大鼠空间学习记忆损害，这可能与模型组神经元损毁的程度较重、神经元修复能力 的极限以及补肾益智方作用的强度、给药剂量和作用机制有关。本研究显示了补肾益智方对 D_ 半乳糖和 IBO 所致 AD 模型大鼠空间学习认知损害的初步保护作用，对其作用的神经生物学基础尚有赖于今后进一步研究和探讨。

　　基金项目：国家“九五”科技重点攻关课题，编号：96-906-09-02

　　作者简介：第一作者，赖世隆　男，1940 年出生，教授，博士生导师；

　　参考文献：

　　［1］胡镜清，赖世隆，王奇，等.补肾益智方对阿尔茨海默病大鼠模型脑内胆碱能神经系统的保护作用［J］.广州中医药大学学报，1999，16(3)：201

　　［2］Morris R.Development of a water_maze procedure for studying spatial learning in the rat［J］.J Neurosci Meth,1984,11:47

　　［3］陈长生，徐勇勇，曹秀堂.医学研究中重复观测数据的统计分析方法［J］.中国卫生统计1996，13(6)：55

　　［4］Davis KL,Thal LJ,Garmzu ER,et al.A double_blind,placebo_controlled multicenter study of Tacrine for Alzheimer's disease［J］.New Engl J Med，1992，327(8):1253

　　［5］Rogers SL,Farlow MR,Doody RS,et al.A 24_week,double_blind,placebo_controlled trial of donepezil in patients with Alzheimer's disease［J］.Neurology 1998，50:136

　　［6］宋前流，宗瑞义，谢湘林.参归煎剂对喹啉酸损毁海马所致痴呆大鼠学习记忆的影响［J］.中草药，1994，25(9)：474

　　［7］林水淼，杨柏灿.补肾活血、调心补肾、化痰开窍改善早老性痴呆的临床研究［M］.见：周金黄，王建华主编.中药药理与临床研究进展(第四册).北京：军事医学科学出版社，1996，202～209

　　［8］吴江.复方益智液对痴呆动物模型学习记忆能力影响的研究［J］.中风与神经疾病杂志，1993(1)：11

　　［9］胡镜清，赖世隆，王奇，等.D_半乳糖加速衰老合并Meynert核损毁大鼠学习记忆能力变化的初步观察［J］.中华老年医学杂志，2000，19(2)：5

收稿日期：2000-03-09