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幽门螺杆菌的SDSP-AGE及免疫印渍分析
http://www.piccc.com  2005-3-1 23:25:25 周志辉、许国铭、张洪富、项兆英]  【字体:

幽门螺杆菌的SDSP-AGE及免疫印渍分析

  幽门螺杆菌(Helicobacter pylorida, Hp)现被公认为是慢性胃炎(CG)及消化性溃疡(PU)的致病因素之一。测定血清Hp抗体方法简便,敏感性高,特异性强,故日益受到关注。有关抗Hp-IgG检测的酶联免疫吸附试验(ELISA)已有报道,但Hp抗原中,哪一部分是免疫反应中抗原的决定簇,目前各家均在探讨。因此我们对Hp抗原作了十二烷基磺酸纳一聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和用人抗血清Hp和兔抗Hp血清作免疫印渍(Western blot),现报告如下。

  1 材料和方法

  1.1 SDS-PAGE

  ①Hp抗原:为本室1989~1990年间分离培养的3株Hp抗原混合物。②CT抗原,由上海市卫生防疫站惠赠。③分子量标准蛋白。④电泳方法:分离胶和浓缩胶的聚丙烯酰胺浓度分别为10%和5%,分离胶的pH为8.8,浓缩胶的pH为6.8。

  电泳前先将Hp、CJ全菌经超声粉碎,然后离心(2000r/min)15min,除去沉淀,经紫外线检测,上清液中蛋白含量为2mg/ml左右,加拌量为60μl,上样前加20μl的样品处理液,然后将标本煮沸5min。相对分子量标准蛋白分别为磷酸化酶94000,牛血清蛋白67000,卵蛋白43000,碳酸酐酶30000,大豆胰蛋白酶抑制剂20000,溶菌酶14000与样品作同步电泳。

  1.2 免疫印渍分析

  ①兔抗人Hp抗体:由本室免疫新西兰大白兔制成。②阳性血清:1989~1990年胃镜检查患者血清,1:100稀释后经ELISA后于波长490nm测定吸光度(A490)>0.6者。同时,胃镜或胃粘膜病理证实有炎症或溃疡。尿素酶试验阳性。③阴性血清:选10岁以下正常儿童血清。1:100稀释后经ELISA测定后A490<0.3者。④酶标羊抗人IgG的制备:按改良的过碘酸钠法,由本室制备。⑤酶标猪抗兔IgG:丹麦Daco公司产品,由上海市卫生防疫站生化免疫室惠赠。⑥硝酸纤维素(NC)纸:西德S&S公司产品,由上海市卫生防疫站生化免疫室惠赠。⑦免疫印渍:按Towbin等方法,由DY-Cl型电泳转移仪以2h400mA将SDS-PAGE胶上的抗原转移至NC纸上。将NC纸置Cohen封闭液中4°C过夜。次日,用含0.05%Tween-20的PBS洗涤3遍,再将NC分别浸于Hp阳性血清中(均为1:100稀释)。37°C振荡2h后,洗涤3遍,加酶标记的羊抗人IGG抗体和猪抗兔IGG抗体(1:400稀释)。37°C振荡2h后,洗涤3遍,再用酶底物显色液(pH7.2的Tris-HCl)缓冲液,0.05%DAB,0.03%的30%H2O2)显色。

  2 结果

  2.1 SDS-PAGE

  经超声粉碎后的Hp抗原被SDS-PAGE分离,胶块用考马斯亮蓝显色,可见14条左右的染色带。其主要染色带Mr分别为22000,32000,42000,59000,67000和75000。

  经超声粉碎后的CJ抗原被SDS-PAGE分离后亦出现了10多条染色带。主要染色带Mr88000,75000,66000,45000和32000。

  2.2 Western blot

  转移至NC上的Hp、CJ超声粉碎抗原用酶标羊抗人IGG抗体分析,发现在阳性血清的NC纸上,可出现三条抗原决定簇条带,其Mr分别为49000,59000和67000,与文献报道相似;加阴性血清的NC纸上,无任何条带出现。在国兔抗人Hp抗血清的NC纸上,用酶标猪抗兔IGG抗体分析,也出现了Mr67000的条带,49000和56000的条带较为模糊。在所有出现Hp抗原决定簇条带的NC纸上,CJ约在45000处与人抗Hp和兔抗Hp抗体均有一明显的交叉反应带。提示该条带并非是因人和兔都同时会有抗CJ抗体引起,而是Hp和CJ的表面蛋白抗原间有交叉反应。

  3 讨论

  我们用SCS-PAGE加Westen blot将分离培养的3株Hp抗原经超声粉碎后,进行抗原成分的分析,在14条左右的候选抗原带中,发现其主要的抗原决定簇Mr为49000,59000和67000。由于处理抗原的方法不同(如用福尔马林固定的整菌抗原、超声粉碎抗原及酸处理抗原等),因此,SDS-PAGE的结果也就不很一致。但目前公认Mr60000~70000的条带是用IGG印渍的Hp主要免疫反应带,与本组结果相同。印渍带属Hp的鞭毛鞘膜蛋白。另外,Dunn等用二维电泳分离Hp蛋白时,在用125I标记的完整Hp菌表面发现两种主要蛋白。其中命名为蛋白Ⅱ的(pH5.6-5.8,Mr66000)既是尿素酶抗原的亚单位,也是部分纯化的鞭毛蛋白制备物的成分。他们还发现,蛋白Ⅱ不被完整的CJ、CF抗血清识别,因此,它是Hp的抗原决定簇。此点与本文也相符。我们没有发现110000的Hp特异性蛋白带,这可能与培养的Hp菌株的不同有关。当然也不能排除与处理抗原的方法不同有关。

  抗原的特异性及标准化至关重要,它决定了该免疫学方法的敏感性和特异性。作者试图通过对Hp的抗原的SDS-PAGE加Western blot检测,找出Hp的特异性抗原决定簇,并以此来取代全菌抗原,建立更为灵敏、特异的血清学方法,从而有助于由Hp引起感染的流行病学调查。由于本文所用的Hp株数量有限,因此它的抗原决定簇可能代表不了所有的Hp株,但它至少反应了1989~1990年间上海地区感染的Hp菌的抗原决定族。

  Clayton等在用基因工程合成的Hp多肽作为抗原与Hp阳性血清作免疫印渍时亦发现66000的合成多肽是Hp的一个主要抗原决定簇。这就为今后简化Hp菌的培养以及Hp菌的标准化、商品化都提供了很好的前景。

周志辉 许国铭 张洪富 项兆英

第二军医大学长海医院(上海 200003)

  

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