您所在的位置:首页 > 医学书籍 > 其它科目 > 动脉粥样硬化
第十五章 血清脂类测定-
-第一节 胆固醇测定
http://www.piccc.com  2005-3-1 23:11:39 ]  【字体:

第十五章 血清脂类测定

  血浆中的脂类包括胆固醇、胆固醇脂、甘油三酯、磷脂和非酯化脂肪酸等。

  目前,对有关脂类代谢疾患的诊断和治疗过程,均必须检测血浆(清)中的脂类,通过其含量的变化,对临床疾患提供协助诊断的依据。有关医学科研工作,脂类的定量检测也是一项必备的研究项目。

  1.胆固醇测定

  血浆中胆固醇及其酯的含量检测,从方法学上可分为两大类:一类是化学法包括抽提法和直接测定法,这类方法目前仍在沿用;另一类是酶法测定,方法敏感特异快速,并能自动化分析,已常规应用。化学测定法种类多,由于显色反应的特异性不同,其结果有一定的差异。目前公认的参考方法是Abell-Kendall(L-B反应)法。另外,三氯化铁-硫酸反应法(Zak法)具有显色稳定法、操作简便、灵敏度约5倍于L-B反应法,胆固醇酯与游离胆固醇显色程度比较接近等优点,缺点是特异性差,干扰因素比L-B法多,如冰醋酸中含有的乙醛酸,血清样品中的血红蛋白,胆红素以及硫酸的质量等因素均可影响Zak方法的准确性,Zak法更适合于科研使用。酶法测定血清胆固醇的方法已被广泛采用,国产试剂已能满足临床的需要。胆固醇测定用的标准品,按美国国家标准局(NBS)出品纯度达99.8%,是国际公认的参考物,国内李健斋等已纯化制成符合这一要求的胆固醇纯品,已供临床检测血清胆固醇使用。

  2.甘油三酯测定

  血浆甘油三酯的测定,目前多以化学法和酶法定量。化学法测定甘油三酯是以脂蛋白变性,水解成甘油,并以甘油为计算依据。酶法是以特异酶水解甘油三酯,除去脂肪酸,再测定甘油,方法特异,准确而快速,临床广为应用。目前甘油三酯测定的方法主要以定量甘油为依据,然而血清样品中存在有游离甘油,如何从反应过程中的总甘油中减去游离甘油,多年来一直在研究讨论这一问题。若不减去,其测定值将会高于血清样品中的真值,如果要减去,就必须先测出血清样品中的游离甘油,甘油三酯的测定方法将增加一个繁杂的步骤,实际工作中难以做到。有报道血清样品中的游离甘油实际量是0.07~0.13mmol/L,相当于甘油三酯的0.5~6.0mmol/L,为此建议,实测的甘油三酯量减去一个校正系数即:

  甘油三酯(mmol/L)=[0.98×总甘油(mmol/L)]-0.07(mmol/L)。

  这一校正系数也仅适用于健康人,对临床病人并不一定适用。据报道,血清样品的游离甘油一直是个未知数,无法测准。为此,目前临床测定血清甘油三酯时,基本上未考虑游离甘油,因为其含量很少,暂且忽略不记。甘油三酯测定的参考物,推荐三油酸甘油酯和三软脂酸甘油酯混合物(2:1,W/W),此参考物适用于化学法。在酶法测定中,仍以高纯度的三油酸甘油酯为参考物。

  3.磷脂测定

  血清磷脂包括卵磷脂、溶血卵磷脂、神经磷脂、脑磷脂和其他少量磷脂。如需要分别检测各种磷脂,可以通过薄层层析法、柱层析法和高压液相色谱法。目前,临床仅测定血清磷脂总量。血清磷脂总量的测定方法有化学方法和酶法两大类。化学法是以磷脂中的磷为定量依据,因为每磷脂分子中都含有一个磷酸根,故将磷脂的磷称为脂性磷。由于血清中磷脂大部分为卵磷脂,其分子量中磷约占4%,故将脂性磷换算成磷脂的系数,一般为25。由于化学法均需要抽提,再测抽提液中的磷脂的磷,血清中的磷酸盐不可能混入抽提液中,因此血清中的磷酸盐对磷脂测定的干扰很少。酶法是利用磷脂酶进行定量测定。生物体中磷脂酶包括磷脂酶A1、A2、C和D四种。磷脂酶D特异性差,均可水解卵磷脂、溶血卵磷脂和神经磷脂,三者约占血清总磷脂的95%,临床多用含磷脂酶d 的试剂进行磷脂的定量测定。

  4.游离脂肪酸测定

  游离脂肪酸属于未酯化的一类脂肪酸,故又称为非酯化脂肪酸,其量很少,采用方法必须是灵敏的方法,还需要避免脂肪水解产生脂肪酸的干扰。测定方法有:①滴定法需要微量滴定装置,因为要通过肉眼观察颜色,难免会有主观因素的影响,所以难以测定准确,很难用于常规;②光度法,以铜皂法常用;③酶法,主要采用特异性不强的脂肪酶D进行检测,方法特异,快速准确,已常规应用于临床。

第一节 胆固醇测定

  血清中胆固醇包括CE和FC,酯型的CE占70%,FC占30%。CE中的C3的-OH在LCAT作用下,可分别结合亚油酸(43%)、油酸(24%)、软脂酸(10%)、亚麻油酸(6%)、花生四烯酸(6%)、硬脂酸(3%)等脂肪酸结合而成。血清中胆固醇在LDL中最多,其次是HDL和VLDL、CM最少。血清总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。

  1.化学法

  化学法一般包括:①抽提;②皂化;③毛地黄皂苷沉淀纯化;④显色比色四个阶段。代表性的方法有Sperry-Webb法,通过①~④步骤操作过程。常规操作中多采用省去了②、③。或者用省去②、③步骤的Zak-Henly法及省去③步骤的Abell-Kendall法,现将此法作为标准参考方法予以引用。

  2.酵法测定

  CE在胆固醇酯酶(cholesterol esterase)作用下水解成FC和NFFA,TC再经胆固醇氧化酶(cholesterol oxidase,COD)氧化成△4胆甾烯酮和H2O2。再分别定量O2的消耗或者H2O2的生成量,或者△4胆甾烯酮生成量,以作为TC的定量依据。该法是目前常规的应用方法,快速准确,标本用量少,便于自动生化分析仪作批量测定。

  一、Abell-Kendall改良法

  1.原理

  血清加入醇溶性氢氧化钾,使胆固醇从脂蛋白中分离出来,同时使胆固醇酯加水分解成游离胆固醇,加石油醚振摇、抽提,使胆固醇移入石油醚层,分离并取一定量的石油醚层,蒸发至干,再进行Liebermann-Burchard 显色反应,620nm比色定量。该法可用于基本功训练及组织细胞胆固醇的提取定量。

  2.试剂组成

代号 种类 浓度 组 成 贮存2~8℃ 有效时间
R1 乙醇 优质纯
R2 石油醚 沸点68℃,特级纯
R3 水醋酸 分析纯
R4 无水醋酸 胆固醇分析用,不含HCI  
R5 浓硫酸 分析纯
R6 KOH液 33%(W/W) KOH10g+H2O 20ml  
R7 乙醇性KOH液 R194ml+R66ml   临用前配制
R8 Liebermann   配制后
Burchard   R420体积+R51体积+R310体积 1h
  试剂*   内用完
R9 胆固醇标准液 5.17mmol/L 胆固醇标准品200mg+R1→100ml 0  

  *:在三角烧瓶内,加入无水醋酸,于冰水中冷至10℃以下,再慢慢加入浓硫酸,混合,静置10min,又加冰醋酸混匀,备用。

  3.操作

图15-1 血清胆固醇(Abell法)测定操作图

  按图15-1操作。

  4.计算

  标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)

  二、酶法(CEH、COD-POD法)

  首先将血清中胆固醇酯在胆固醇酯酶(CEH)水解为游离胆固醇和脂肪酸,胆固醇在胆固醇氧化酶(COD)作用下,生成△4-胆甾烯酮和H2O2,再H2O2经过氧化物酶(POD)作用在4-氨基安替比林(4-AA-P)及N-乙基-N-(3-磺基醋酸)-3甲氧基苯胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS)参与下,生成红色醌亚胺色素。

  H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林→红色醌亚胺色素

  (一)手工测定法

  1.试剂组成

代号 种类 浓度 组成 贮2~8℃ 有效时间
  Na2HPO4 50mmol/L      
  Na2H2PO4 50mmol/L      
  胆酸钠 3mmol/L      
  4-氨基安替比林 0.82mmol/L      
R1* ESPAS 14mmol/L     24h
  Carbowax-6000 0.17mmol/L      
  CEH 33U/L      
  COD 117U/L      
  POD 6700U/L      
R2 标准液 5.17mmol/L 用异丙醇溶解胆固醇    

  *混匀,调pH至6.70±0.10(25℃),或购买试剂盒。酶以活性单位表示。

  2.操作

  按图15-2操作。

  3.计算

  标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)

  (二)自动化分析仪测定

  以CL-7200型全自动生化分析仪检测为例。

  1.试剂组成

  A液:CEH、POD、抗坏血酸氧化酶等。

  B液:COD、4-氨基安替比林等。

图15-2 血清胆固醇测定(酶法)操作图

  2.上机参数

项 目 参 数
方 法 终点法
波 长 双波长(540nm,700nm)
反应温度 37℃
试剂A反应时间 2~3min
试剂B反应时间 5~6min
样本用量 3μl
试剂A用量 250μl
试剂B用量 120μl
单位 mmol/L

  3.操作过程

  4.计算

  以△A=A2-A1,根据同样处理之标准或质控物计算,打印结果。

  5.注意事项

  (1)试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。

  (2)试剂在有效内2~8℃避光食保存。

  (3)胆固醇含量超过200mmol/L,需用生理盐水稀释再测。

  

页面功能 【参与评论】【收藏此文】【打印文章】【网上投稿关闭窗口
上一编:第二节 甘油三酯测定
下一编:第四节 低密度脂蛋白受本基因表达的抑扬

栏目列表