《中国幽门螺杆菌研究》 > 2.幽门螺杆菌的基础实验研究

猪胃螺杆样细菌与幽门螺杆菌的比较研究

1983年,Warren和Marshall在患慢性胃炎和消化性溃疡病人的胃粘膜中发现一种弯曲状细菌。现称之为幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori, Hp)。此后,各国学者相继进行了大量的研究。证明幽门螺杆菌很可能是慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病菌。据报道幽门螺杆菌感染悉生仔猪获得成功,表明猪可能是一种敏感动物。那么,在自然条件下,猪是否有幽门螺杆菌的感染并并发胃粘膜的病变呢?为此我们对正常猪胃做了微生物学和病理组织学检查。结果发现在猪胃粘膜中存在有螺杆菌样细菌(Heliocbacter-like organisms,HlO)其形态和某些生物学性状与幽门螺杆菌基本相同,而且HLO阳性的猪胃粘膜,呈现与人慢性胃炎相似的病理变化,现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 标本来源 猪胃10个,从北京沙河肉联厂新屠宰的健康猪中随机取出,有70%酒精消毒后沿胃大弯剪开,清除内容物用无菌操作分别从胃窦、胃底和胃体部剪取胃粘膜组织各4块,其中2块用缓冲的10%福尔马林固定,供病理学研究,另2块组织供细菌培养用。

1.2 螺杆菌培养 将从胃窦、胃底和胃体部取得的粘膜组织,分别置于无菌玻璃研磨器中,加0.5ml含10%小牛血清的布氏肉汤,研磨成匀浆后,取0.1ml接种于含6%羊血的布氏培养基平板中,放置于混合气体(10%CO2,5%O2,85%N2)培养72h后观察结果。另取胃粘膜匀浆一小滴于载玻片上,推片凉干用甲醇固定,0.3%复红染色后,直接镜检。

1.3 全菌蛋白电泳分析 用SDSPAGE技术,对幽门螺杆菌(菌株号为NCTC14126,CAPM00112-5),空肠弯曲菌(菌株号为Cj22,Cj26,流G15),结肠弯曲菌(菌株号CC29)和分离到的猪胃螺杆菌作了全菌蛋白电泳图谱的比较。实验条件为浓缩胶5%,分离胶11%,各菌体蛋白样品20μl+2×buffer20μl 100°C水浴5min且加样,50V恒压2h时,75V恒压12h,考马斯亮蓝R-250染色。

1.4 药敏试验 抗菌药物敏感试验所用试纸,系由大连生物试剂厂生产,被试菌株为猪胃螺杆样菌37°C48h培养物,用0.1%胨生理盐水洗下,制成2×109cfu/ml菌液,取0.1ml菌液均匀涂于布氏培养基表面贴药敏试纸7张,然后置于混合气体培养箱中,孵育48h~72h,测量抑菌圈直径。

1.5 病理学检查 经福尔马林固定的组织标本,用石蜡包埋作5μ厚度的切片,每个标本4张。2张用苏木素一伊红染色,作病理组织学观察;另2张用Warthin-Stsrry镀银染色,检查弯曲菌。

2 结果

2.1 猪胃螺杆样菌的分离 在10例猪胃标本中,有8例分离到HLO。若按不同部位猪胃粘膜的分离阳性率来看,以胃底部为最高(8/10),其次为胃窦部(4/10),胃体部最低(3/10),结果见表1。猪胃HLO的菌落较小,约0.5mm~1mm直径,呈圆形、扁平、湿润、半透明,偶或可见菌落周围有β微溶血。菌体较纤细着色良好,呈弧形,S形或海鸥展翅状。其中第5例标本,除典型的弯曲菌外,还发现一种螺旋状菌,该菌螺旋较致密,螺旋数由数个至十数个不等,其形态与从猫中分离的螺旋菌十分相似。

2.2 幽门螺杆菌与猪胃螺旋杆菌的生化特性 我们将分离到的猪胃HLO,包括致密螺旋菌与幽门螺杆菌做了生化特性的比较,结果见表2。如表2所示,猪胃HLO,除尿素酶试验较迟缓外,其他各项生化反应均与幽门螺杆菌一致,而猪胃致密螺旋菌除尿素酶试验较迟缓外,H2S产生为阴性。

2.3 全菌蛋白的电泳图谱分析 两株幽门螺杆菌(NCT11637,CAPM112)的电泳电谱相似;空肠弯曲菌(Cj22,Cj26,流G15)和结肠弯曲菌(CC29)的图谱相似;各株猪胃HLO(6B,6C,7B,7C,10B,10C)之间的图谱亦相似,但明显不同于Hp与空肠弯曲菌的图谱。从同一动物不同部位分离的猪胃HLO,其图谱相同,而从不同动物分离的猪胃HLO,其全菌蛋白图谱有微细的差别。

2.4 药敏试验 猪胃HLO(1a,9a)的药敏试验结果表明,这些菌株对呋喃唑酮、红霉素、氯霉素和庆大霉素均敏感,而对羟氨苄青霉素、先锋霉素、萘啶酮酸等耐药。

2.5 病理组织学研究 在10例猪胃标本的组织切片中,有7例检查到螺杆样细菌(表1),这些细菌往往成群或散在地存在于粘液层,粘膜上皮表面或粘膜腺体内。这些细菌,有的呈弧形,有的呈S形,其形态与在慢性胃炎病人胃粘膜中所见到的幽门螺杆菌十分相似。这7例细菌阳性的胃粘膜组织都呈现中等度到较严重的慢性炎症病灶,主要表现为粘膜和固有层大量的单核细胞、淋巴细胞和浆细胞浸润,间或有少量嗜伊红细胞和多形核白细胞浸润。有些病灶伴有淋巴滤泡形成。有意义的是这些病变,只见窦部和底部的粘膜而胃体部组织则无一例出现上述病变(表1)。

表1 猪胃粘膜HLO培养和病理组织检查结果

标本编号胃粘膜肉眼观察HLO培养结果慢性炎症病变组织切片检检菌
胃底胃窦胃体胃底胃窦胃体
1正常++++
2正常
3正常++++
4正常+++++
5正常++++
6充血,点状出血++++++
7充血,点状出血++++++
8正常
9正常+
10正常++++++

表2 幽门螺杆菌与猪胃中HLO的生化反应比较

菌 株氧化酶过氧化氢酶葡萄糖发酵H2S产生马尿酸水解0.5%

NaCl
0.5%

NaCl
尿素酶试验
幽门螺杆菌NCTC11673+++++(4h)
猪胃弯曲菌7a+++++(36h)
猪胃密螺旋菌WL5a++++(24h)

3 讨论

在某些哺乳动物的胃粘膜中,也曾发现有幽门螺杆菌样细菌,但除雪貂外,一般不引起病变。我们从在自然条件下生长的普通猪胃中分离到螺杆菌样细菌,而且阳性率相当高(80%)。猪胃HLO的菌落和菌体形态与Hp十分相似,某些生化反应特性两者形态也基本一致,但HLO的尿素酶活性较低。SDS-PAGE全菌蛋白图谱表现猪胃HOLO和Hp的图谱差别也较明显。两者的种属关系如何有待进一步研究。在HLO培养阳性的8例猪胃中,有7例在其组织切片中发现为数较多的HLO,同时伴有慢性胃炎病变。就其病变的性质而言,与人的慢性胃炎基本相同,但是,其发生病变的范围较广,累及窦部和底部,而与Hp感染相关的人的慢性胃炎,多发生于窦部,正常猪出现胃炎病变,看来产不少见,例如Kathryn在其作为对照组的某些猪的胃组织中曾观察到慢性炎症病变,对此作者未作解释。猪的胃肠系统在解剖学和生理学上类似于人类,而且近来在人和猪的胃组织中均检查到甘油脂(glycero lipid),后者被认为是胃粘膜上的幽门螺杆菌的受体。

综上所述,我们认为猪胃HLO与猪慢性胃炎的关系,犹如Hp与人慢性炎的关系。在Hp不易感染其他动物的情况下,研究HLO对猪慢性胃炎的致病作用,或将有助于阐明Hp对慢性胃炎和消化性溃疡的致病机理。鉴于猪能自然感染螺杆菌样细菌并有慢性胃炎,因此用猪做幽门螺杆菌感染试验,在分析结果时应审慎。