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失眠是临床常见的睡眠障碍性疾病，调查显示，全球失眠的发病率为28%，中国成年人失眠发病率达38.2%，超过3亿中国人有睡眠障碍[1]。随着我国社会经济的高速发展，社会越来越多元化，复杂的社会生态和老龄化日益加剧都影响着人们的心身健康，失眠患病率日益增加。因此研究失眠的病因病机和治疗，具有重要意义。
栀子豉汤出自《伤寒杂病论》第76条：“发汗后，水药不得入口，为逆，若更发汗，必吐下不止。发汗吐下后，虚烦不得眠，若剧者，必反复颠倒，心中懊，栀子豉汤主之。”栀子豉汤由炒栀子、淡豆豉组成，栀子苦寒，清透郁热，解郁除烦，可导热下行；淡豆豉气味俱轻，既能透表宣郁，又可和降胃气[2]；两药配伍，清中有宣，宣中有降，共奏清宣郁热之效。此方药简效宏，是治疗热郁胸膈不寐的经方。现代研究表明，栀子中的主要活性成分环烯醚萜苷类具有抗炎、抗氧化、降血脂，改善失眠、焦虑、抑郁症状等多种药理作用[3]。目前，关于栀子豉汤镇静催眠作用的研究较少，本实验拟通过研究栀子豉汤对小鼠的镇静催眠作用，初步探讨其在镇静催眠方面的作用机制。
1 研究材料
1.1 仪器
恒温水浴锅（金坛市精达仪器制造公司，HH-6数显恒温）；电子天平[丹佛仪器（北京）有限公司，型号：MP6001]；微量台式高速离心机（Cat.No:911115110000);BioTek酶标仪（美国，BioTek Instruments,Inc);Nikon80i生物显微镜摄像系统（日本，尼康公司）。
1.2 试剂与药材
炒栀子、淡豆豉由河南中医药大学第一附属医院提供，符合《中华人民共和国药典》2015年版规定；天王补心丹（芜湖张恒春药业有限公司，生产批号：1811071,36g/瓶）；氯化钠注射液（河南科伦药业有限公司，生产批号：A18013101-2）；戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司，CAS:57-33-0，生产批号：TP20160910,25g/瓶）；去甲肾上腺素（NE)ELISA检测试剂盒（生产批号：CK-E91494M);5-羟吲哚乙酸（5-HIAA)ELISA试剂盒（生产批号：CK-E91467M）。试剂盒均为南京建成生物工程研究所有限公司提供。
1.3 实验动物
CD-1(ICR）种小鼠[由北京维通利华实验动物技术有限公司提供质量检测，单位许可证号：SCXK（京）2016-0006，编号：11400700380031]50只，SPF等级，雌性，体质量为（30±2)g，室温为（25±2）℃，通风条件下适应性饲养3d，小鼠自由饮水和摄食，水源和饲料均经过合格检验。
2 研究方法
2.1 药物制备
栀子豉汤在《伤寒杂病论》中描述为“栀子十四枚，擘香豉四合，绵裹；上两味，以水四升，先煮栀子，得两升半，内豉，煮取一升半，去滓，分为二服，温进一服，得吐者，止后服”。根据现代临床应用剂量折算为炒栀子9g，淡豆豉4g。本实验选用炒栀子45g，淡豆豉20g，熬制时先将炒栀子放入2 000mL水中，煮至1 250mL后加入淡豆豉，最后浓缩至313mL(1mL药液中约含有生药0.208g）。取2份适宜剂量原液，用蒸馏水分别稀释到25%、50%，与原液分别组成栀子豉汤低、中、高剂量组，冰箱-4℃保存。将天王补心丸配制成浓度为0.1g/mL的水溶液。将戊巴比妥钠配制成浓度为0.3%的氯化钠溶液。
2.2 动物分组及给药方法
选取CD-1(ICR）小鼠50只，随机分为空白对照组、天王补心丹组、栀子豉汤高剂量组、栀子豉汤中剂量组、栀子豉汤低剂量组，每组10只。每日8∶00—9∶00按照下列剂量给小鼠灌胃给药1次：栀子豉汤高剂量组按日给药剂量4 330mg/kg（按人/鼠体表面积等效剂量换算，相当于成人剂量的20倍）灌胃，栀子豉汤中剂量组按日给药剂量2 170mg/kg（相当于成人剂量的10倍）灌胃，栀子豉汤低剂量组按日给药剂量1 080mg/kg（相当于成人剂量的5倍）灌胃，天王补心丹组按日给药剂量2 000mg/kg（相当于成人剂量的10倍）灌胃。空白对照组按等体积氯化钠注射灌胃。每日灌胃1次，每组连续给药7d。
3 观察指标与结果
3.1 小鼠状态观察
观察每组小鼠的饮食、排便、体质量、精神和活动情况等一般状态，统计死亡率。空白对照组和栀子豉汤低剂量组实验过程中各死亡1只。
3.2记录翻正反射消失时间及睡眠持续时间
最后1次灌胃给药1h后，进行镇静催眠实验。腹腔注射已配制的戊巴比妥钠溶液，按每只45mg/kg的剂量给药，密切观察并详细记录小鼠的翻正反射消失时间（从给小鼠注射戊巴比妥钠到小鼠无法自主翻身的时间）及其睡眠持续时间。实验在室温（25±2）℃、通风、安静条件下进行，不可对睡眠小鼠有任何人为干预帮助苏醒。
3.3 小鼠脑组织NE、5-HIAA检测
第7日药物灌胃24h后断头处死小鼠，在冰上立即取出脑组织，用氯化钠注射液轻轻冲洗，去除血迹，然后放在滤纸上，快速将水吸干净。精密称重，用锡箔包裹，储存在-80℃冰箱中，待测。采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定小鼠脑组织中NE、5-HIAA的含量。测定步骤如下：室温环境中把试剂盒均衡20min以后，从铝箔袋中取出实验所需的板条数目；设置好标准品孔和样本孔，其中R为空白孔；样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加；除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，装进原来的铝箔袋中，用保鲜膜缠裹，放在37℃的水浴锅中温育60min；把包裹住的板条拿出来，迅速翻转倒出孔中液体，并用吸水纸吸干，每孔用洗涤液滴满，1min后迅速翻转倒出洗涤液，用吸水纸吸干，重复此过程5次；把底物A、B分别滴至每个孔里，均滴加50μL，用封板膜封住板条，装入铝箔袋中，用保鲜膜包裹，在37℃的环境下避开光照，孵育15min；然后取出板条，在每个孔中滴加50μL终止液，15min内在450nm波长的酶标仪里测定各孔的OD值，并将数据记录保存。
3.4 统计学方法
采用SPSS 19.0统计学软件处理数据。每组数据用单因素方差分析，以均数±标准差表示，采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
3.5 结果
(1）翻正反射消失时间、睡眠持续时间比较与空白对照组比较，栀子豉汤高、中剂量组和天王补心丹组小鼠的翻正反射消失时间显著缩短，栀子豉汤高、中剂量组、天王补心丹组小鼠睡眠持续时间延长，差异具有统计学意义（P<0.05）；天王补心丹组与栀子豉汤高剂量组翻正反射消失时间、睡眠持续时间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
(2)NE、5-HIAA含量比较与空白对照组比较，天王补心丹组、栀子豉汤中、高剂量组小鼠脑组织中的5-HIAA含量水平显著升高（P<0.05),NE含量水平显著降低（P<0.05）；天王补心丹组与栀子豉汤高剂量组小鼠脑组织中的NE、5-HIAA含量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
4 讨论
不寐是以经常不能获得正常睡眠为特征的一类病证，主要表现为睡眠时间及深度不足，轻者入睡困难，或寐而不酣，时寐时醒，或醒后不能再寐，重则彻夜不寐[4]。失眠在女性和老年人群中发病率较高，老年人失眠发病率为12%～25%，伴有生理、心理性疾病的老年人群发病率更高[2]。随着社会经济的发展，生活节奏的加快，年轻人也开始出现各种各样的失眠问题，失眠患者普遍存在高发病率和高共患病性的特点[5]。长期失眠会导致记忆力减退、认知能力下降，甚至诱发心脑血管及神经性疾病[6]。西医治疗失眠主要以药物和心理治疗为主，镇静催眠药物不良反应明显，心理疗法也有一定局限性。中医药治疗失眠，具有疗效好、安全性高、不良反应少等优势。
栀子豉汤用于治疗热郁胸膈、虚烦不得眠之证，由栀子和淡豆豉两味药物组成。栀子始载于《神农本草经》，味苦性寒，归心、肺、三焦经，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒之功，善清三焦火邪，泻心火而除烦，为治热病心烦、燥扰不宁之要药。《名医别录》谓其可疗“胸心、大小肠大热，心中烦闷”。《本草衍义》云：“栀子虽寒无毒，治胃中热气，既亡血、亡津液，腑脏无润养，内生虚热，非此物不可去。”现代药理学研究表明，栀子具有镇静作用，加热炮制后镇静作用增强[7]。《本草从新》谓豆豉：“苦泻肺，寒胜热，发汗解肌，调中下气，治伤寒寒热头痛，烦躁满闷，懊不眠，发斑呕逆。”《本草易读》云豆豉：“调中下气，除烦止呕。”两药合用，清中有宣，宣中有降，互济互用，为轻宣胸中郁热，治虚烦懊不眠之良方[3]。
天王补心丹为安神剂，现代临床常用于治疗神经衰弱、心脏病、精神分裂等所致的失眠、心悸证[8]。目前，对于天王补心丹的临床应用及药理药效研究比较成熟，其治疗失眠多虑的疗效良好，故本实验将其作为栀子豉汤的对照品。
NE是维持睡眠觉醒的重要神经递质，在脑组织中的海马体、丘脑等部位含量较高，通过促进神经元兴奋达到维持觉醒的目的。失眠与大脑中的NE含量升高密切相关，研究表明，药物可通过降低脑组织中NE水平，抑制其维持觉醒的作用[9]。5-羟色胺（5-HT）生成的无活性酸性代谢终产物可间接反映5-HT的变化，5-HT为失眠的重要参考指标。如在抑郁症失眠模型动物的脑组织中，5-HT与5-HIAA均有所下降[10]，动物被剥夺睡眠后，其脑组织内海马、下丘脑的5-HIAA与5-HT的比值上升，提示失眠能使脑中5-HT的代谢率升高。
本研究结果显示，与空白对照组比较，栀子豉汤高、中剂量组和天王补心丹组小鼠的翻正反射消失时间显著缩短（P<0.05），栀子豉汤高、中剂量组、天王补心丹组小鼠睡眠持续时间延长（P<0.05），且小鼠脑组织中的5-HIAA含量水平显著升高（P<0.05),NE含量水平显著降低（P<0.05）；天王补心丹组与栀子豉汤高剂量组翻正反射消失时间、睡眠持续时间及小鼠脑组织中的NE、5-HIAA含量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。表明栀子豉汤与天王补心丹均有镇静催眠作用，能与戊巴比妥钠产生协同作用，缩短小鼠翻正反射消失时间，延长小鼠的睡眠持续时间，且高剂量组效果更明显，这与张仲景利用其治疗“虚烦不得眠”一致；且提示栀子豉汤能在一定程度上降低小鼠脑组织海马、下丘脑中NE的含量，降低脑部神经元的兴奋性，降低其维持觉醒的综合能力。5-HIAA的含量升高，可能与5-HT代谢增多有关。栀子豉汤低剂量组小鼠的睡眠持续时间略高于空白对照组小鼠，但无明显差异，且小鼠脑组织中NE、5-HIAA含量并无明显变化，可能因为栀子豉汤剂量过低，在有限的给药期间未产生相应的药理作用。
综上所述，栀子豉汤对小鼠有镇静催眠作用。栀子豉汤高剂量组作用效果最佳，其机制可能与神经递质5-HT、5-HIAA有关，符合镇静催眠小鼠脑组织中神经递质的变化情况[11]。本研究为栀子豉汤抗焦虑、抑郁和治疗失眠的临床药理学研究做了一定补充，但栀子豉汤的镇静催眠作用对小鼠脑组织中神经递质的具体影响，需要进一步探讨及研究。
来源：中国民间疗法 作者：康璐 刘倩 刘玉晔 崔书克
河南中医药大学第三临床医学院
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