免疫组织化学技术在幽门螺杆菌研究中的应用

　　中国人兽共患病杂志2000年第16卷第3期

肖文平(综述)　张建中(审校)

　　关键词；幽门螺杆菌　免疫组织化学

　　自从1983年Marshall分离培养出幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,简称Hp)以来，大量研究表明，Hp与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌的发生有密切关系。目前Hp的研究，已经从传统的形态学发展到分子生物学水平，也发展了一系列技术方法，如形态学观察、组织染色、免疫组织化学染色、PCR等。由于免疫组织化学技术具有特异性强、定位准确、形态与功能相结合等特点，在Hp的研究中占有重要地位。现将免疫组织化学技术在Hp检测、流行病学调查和致病机理三个方面的探讨作一综述。

　　1　免疫组织化学用于Hp的检测

　　1.1　在80年代，谭巨莲和Barbosa等发现细菌培养与免疫组化(间接免疫荧光、PAP)对Hp检测结果基本一致。最近的研究也表明免疫组织化学技术具有特异性高、稳定性好等特点。有人用细菌培养作为标准，对改良Gimesa(MG)、Warthin-Starry(WS)银染和免疫组化(IMM)的Hp检测能力进行评价，发现这三种方法的敏感性依次为90.0±10.0%、70.0±14.1%、83.8±11.1%；特异性依次为53.8±19.3%、82.5±19.6%、90.0±0.0%；四位观察者之间的变异，免疫组化最小^［1］。此外对Hp感染量少和抗生素根除Hp治疗后的病人，结果表明免疫组化是准确、稳定、可靠的检测Hp的方法^［2～3］。

　　1.2　由于上述优点，免疫组化不仅用于直接检测Hp，还可用于评价其它的检测方法。如用于溃疡穿孔、出血、坏死的病人、早期胃癌病人、胃原发淋巴瘤的病人及各种临床根除Hp治疗后，Hp的检测^［4～5］。Misawa等用免疫组化和细菌培养，来评价血清学方法，发现用细菌培养作为标准，血清学方法的敏感性和特异性分别为87.2%、82.1%；用免疫组化作为标准，血清学方法的敏感性和特异性分别为94.0%、96.7%，用细菌培养作为标准，易出现假阴性^［6］。Tokunage等用免疫组化作为标准来评价快速尿素酶实验和细菌培养的敏感性、特异性^［7］。

　　1.3　免疫组化检测Hp，可在组织和细胞内对其进行准确的定位，且还可以与其他抗原在同一组织或细胞中进行定位观察。Tazawa等用免疫组化对一个胃镜下发现多发性溃疡且细胞内出现罗氏包涵体的53岁病人进行染色，发现Hp定位于胃小凹上皮细胞、基底细胞和巨噬细胞胞浆中。Gisbertz等用免疫组化对52例胃原发淋巴瘤病人进行检测，发现有3例Hp定位于胃腺体。Engstrand等用免疫组化对HLA-DR、人Hsp60和Hp的Hsp60进行染色，结果Hp的Hsp60存在于胃粘膜表面和胃上皮细胞内，并且和HLA-DR协同表达，而人Hsp60则无此现象^［8］。这些特殊的发现都是以往传统的方法所不能奏效的。

　　2　免疫组化用于Hp的流行病学调查

　　尽管免疫组化技术操作比较复杂、价格相对昂贵和速度相对较慢，但凭其特异性高、稳定性好等特点，可以用于样本例数较少的特殊人群的流行病学调查。用免疫组化对某医院1986～1995年间因溃疡出血、穿孔、坏死而做手术的病人进行Hp检测，发现穿孔型溃疡比出血型及坏死型的Hp感染率高，密度大，并具有显著性差异，支持Hp感染与溃疡穿孔的关系密切^［4］。Ectker等对某医院1963～1997年间来体检的2497人进行回顾性的研究，发现26人患有早期胃癌(ECG)，在用免疫组化检测14人的胃粘膜标本中，Hp阳性率为79%。余东红等用免疫组化和H-E染色对136例胃恶性肿瘤进行Hp-L型检测，结果用免疫组化进行检测，Hp-L型的阳性率为71.3%。用免疫组化对12例并发胃原发淋巴瘤和胃癌的病人进行Hp检测，发现12人全部为Hp阳性，为Hp与这两种恶性肿瘤的发展相关提供了流行病学支持^［5］。Nakamura对237例胃原发淋巴瘤病人，采用免疫组化、MG、H-E对Hp染色，发现淋巴瘤限于胃粘膜及粘膜下的病人，Hp阳性率显著高于淋巴瘤超过胃粘膜下的病人；淋巴瘤限于胃粘膜及粘膜下的病人Hp阳性率，和慢性活动性胃炎及消化性溃疡病人一致。

　　3　免疫组化在Hp致病机理研究中的应用

　　大量研究表明，Hp和慢性胃炎、消化性溃疡密切相关。近年来，越来越多的研究表明，Hp的感染也与胃癌的发生密切相关。用免疫组化技术探讨Hp致病机理，具有重要的科学意义。现将其从五个方面来总结：

　　3.1　免疫组化在研究Hp炎性作用中的应用　Hp感染可使胃粘膜组织发生炎性反应。Hp感染引起的炎性反应，不仅有炎性细胞、免疫细胞、细胞因子参加，而且还有补体系统及粘附分子参加。用免疫组化技术研究表明，Hp感染可促使肥大细胞的数量及其脱颗粒的数量增多^［9］。做过胃腺癌切除的Hp阳性病人，胃上皮细胞中性粒细胞的数量随着胃炎的发展而显著增加^［10］。用免疫组化技术对T细胞表面抗原和细胞因子进行染色，发现CD₄⁺和CD₈⁺的T细胞在Hp感染部位增加，且都能产生INF-α；对新鲜分离的T细胞进行短暂刺激，可表达IFN-α和IL-2，但不能产生IL-5或IFN-β，说明Hp感染后，主要是TH₁辅助细胞增加，它在免疫反应中属于调节细胞，可以分泌多种细胞因子，有助于炎症的发生、发展^［11］。IL-8可以促使白细胞激活和趋化。用免疫组化对IL-8进行染色，发现Hp阳性的溃疡和胃炎病人IL-8含量增加^［12］。GM-CSF(粒-巨噬细胞集落刺激因子)也是参与炎性调节的重要的细胞因子。Beales iL等观察Hp和人胃AGC瘤细胞共同培养24h以后，用免疫组化对GM-CSF染色研究，发现Hp阳性的标本，无论加或不加刺激物，都比Hp阴性的标本产生的GM-CSF要多，支持了GM-CSF也是参与Hp感染引起的炎性反应的重要细胞因子。用免疫组化对补体C3和补体末端复合物(TCC)进行染色，发现TCC明显存在于胃炎病人的胃上皮细胞表面、Hp阳性的胃腺周围及Hp阴性的某些胃炎的病人；具有活性C3b存在于胃上皮细胞的顶面，在Hp阳性的胃窦和胃体粘膜，比Hp阴性组含量显著增多。Hp菌在胃小凹开口处被有活性C3b覆盖，但很少在Hp大量存在的胃小凹内^［13］。这支持了Hp感染可能激活局部的补体系统，及Hp逃避补体攻击的机制。粘附分子可以在细胞与细胞之间、细胞与细胞间质之间相互联系、传递信息、介导炎症反应。Sakai用免疫组化对Hp相关的慢性胃炎病人的胃粘膜中的粘附分子ICAM-1、LFA-1和mac-1进行检测，发现ICAM-1在毛细血管和上皮细胞间的炎性细胞(如淋巴细胞和粒细胞)表面表达特别高；抗原呈递细胞(如巨噬细胞)表达ICAM-1和HLA-DR，LFA-1和mac-1在这些免疫细胞和Hp感染细胞中都表达。Hp根除后这些粘附分子表达都下降^［14］。

　　3.2　免疫组化用于研究Hp感染引起的胃粘膜的增生　Hp感染可促使胃粘膜增生。可用细胞核增殖抗原(PCNA)和Ki67等细胞固有抗原来评价组织的增生程度。应用免疫组化技术对Ki67抗原进行检测，发现Hp根除后，胃粘膜上皮增殖明显减少^［15］。免疫组化对Ki67抗原进行检测，发现随着Hp相关的慢性胃炎发展，胃粘膜上皮增殖也不断增加，并且在与胃癌相关的不完全肠化生中腺体增生最显著^［10］。余东红等用免疫组化研究表明：Hp-L型与胃病变组织的PCNA过度表达存在着相关性，支持Hp-L型感染的胃粘膜可能处于一种高度增殖状态。多数研究者认为，Hp感染可促使胃粘膜处于高增殖状态，这种状态是对胃粘膜细胞损伤和破坏的反应。尽管如此，但Hp对胃粘膜的增生机制还不完全清楚。但多数学者认为，Hp使胃粘膜增生存在着间接的反应过程。用免疫组化研究，发现Hp感染能够促使IL-1、IL-6、TNF-α、EGF和TGF分泌增加^{［16～17］}。这些能使胃粘膜增生的细胞因子的含量增加，支持了Hp可能通过细胞因子间接促使胃粘膜增生。

　　3.3　免疫组化用于研究Hp致癌的基因改变机制　大量的文献表明胃癌的发生、发展与多种基因的改变有关，不只一种基因在起作用，而是多种基因长期共同作用的结果，主要是癌基因的激活和抑癌基因的失活或突变。和胃癌有关的癌基因比较重要有c-met、P²¹、ras、c-erbB-2和P⁵³突变型等；抑癌基因有P⁵³野生型、P¹⁶、DCC、APC、MCC和RB等。用免疫组化对胃癌组织中癌基因与癌基因的表达进行检测，是有效发现Hp导致胃癌发生的基因变化机制的手段之一。目前，对于Hp能否引起胃癌发生的基因变化的观点不一致。有人用免疫组化对胃癌病人胃粘膜及胃癌组织c-erbB-2、P⁵³癌蛋白进行检测，认为这二种基因的过度表达不受Hp感染的影响^{［18～19］}。但许多免疫组化证据表明PCNA、P²¹、P⁵³和c-met等癌基因的过度表达和抑癌基因P¹⁶表达下降与Hp感染相关^{［20～22］}。

　　3.4　免疫组化用于研究Hp感染引起的自身免疫　目前，Hp感染引起的自身免疫正逐渐成为国内外研究的热点。Yamaguchi等用免疫组化技术研究，发现Hp的Hsp60两种单克隆抗体：MAbH₂₀(IgM)和MAbH₉(IgG_2a)，只有MAbH₂₀(IgM)和胃上皮细胞抗原发生交叉免疫反应。有关文献报道：Hp感染相关疾病病人，抗胃壁细胞胞内微管抗体阳性率为30%～50%^{［23—24］}。Faller用免疫组化研究认为Hp和宿主Lewis x或Y血型抗原分子拟态而导致抗胃壁细胞胞内微管抗体的产生^［23］。用免疫组化研究表明，Hp感染相关的抗体可能直接通过抑制质子泵或通过胃粘膜萎缩发展而造成的胃酸分泌降低^［24］。Ko等用免疫组化对包括Hp感染的胃粘膜组织在内多种人体组织进行染色，发现Hp不仅可以与胃粘膜上皮细胞有交叉免疫反应，还与唾液腺细胞、肾小管细胞及十二指肠上皮细等有交叉免疫反应。为Hp感染能引起全身自身免疫反应提供了证据。

　　3.5　免疫组化用于研究Hp感染引起的胃粘膜局部的微环境的紊乱　Hp感染以后，在胃粘膜局部，细菌分泌的酶及其分解的有害产物等引起微环境的紊乱，超出胃粘膜自身清除的能力，就会造成胃部病理改变。而Hp在癌变的过程中，逐渐不适应局部微环境改变而减少，这和流行病学上Hp和早期胃癌相关是一致的。余跃等用改良的PAP免疫组化方法研究表明，Hp感染可以促使胃窦粘膜血管活性肠肽(VIP)含量降低，P物质(SP)增高，SP可以刺激人多形核白细胞(PMN)产生O^-₂和H₂O₂，并能显著增强FMLP甲酯对PMN的刺激作用，产生H₂O₂^［25］。这些活性氧代谢产物具有细胞膜毒性，损伤细胞膜。Hahm等用免疫组化研究表明，Hp感染可增强氮氧化物合成酶(iNOS)活性和细胞程序性死亡。

　　免疫组化在Hp研究中得到了广泛而深入的应用，但它的作用还没有充分发挥出来。大量商品化的试剂与试剂盒的出现，可以提高免疫组化的灵敏性、特异性及稳定性，简化操作步骤、缩短操作时间，为免疫组化在Hp研究中进一步应用提供了有力的支持。相信免疫组化技术在Hp研究中将会发挥越来越重要的作用。

　　肖文平（中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所腹泻病研究室　北京,102206)

　　张建中（中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所腹泻病研究室　北京,102206）

　　参考文献

　　1，Jonker D，et al.Evaluation of immunohistochemistry for the detection of Helicobacter pylori in mucosal biopsies［J］.J Infection，1997,35∶149.

　　2，Jonker D，et al.Ongoing gastric acid inhibition is a comfunding factor in helicobacter pylori diagnose［J］.Eur J Gastroenterol Hepatol,1997,9(1)∶49.

　　3，Marzio L，et al.Anti-Helicobacter pylori specific antibody immunohistochemistry improves the diagnostic accuracy of Helicobacter pylori in biopsy specimen from patients treated with triple therapy［J］.Am J gastroenterol，1998，93(2)∶223.

　　4，Tokunaga Y，et al.Density of Helicobacter pylori infection in patients with peptic ulcer perforation［J］.J Am Coll Surg，1998，186(6)∶659.

　　5，Nakamura S，et al.Synchronous and metachronous primary gastric lymphoma and adenocarcinoma：a clinicopathological study of 12 patients［J］.Cancer，1997,79(6)∶1077.

　　6，Misawa K，et al.A new histological procedure for re-evaluation of the serological test for Helicobacter pylori［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，1998，17(1)∶14.

　　7，Tokunaga Y，et al.Semiquantitative evaluation for diagnosis of Helicobacter pylori infection in relation to histological changes［J］.Am J Gastroenterol，1998，93(1)∶26.

　　8，Engstrand L，et al.Is the sanctuary where Helicobacter pylori avoids antibacterial treatment intracellular［J］. Am J Clin Pathol，1997，108(5)∶504.

　　9，徐克强,等.胃粘膜肥大细胞在幽门螺杆菌致病中的作用研究［J］.新消化病学杂志，1997,5(7)∶449.

　　10，Yabuki N，et al.Analysis of cell damage and proliferation in Helicobacter pylori-infected human gastric mucosa from patients with gastric adenocarcinoma［J］.Am j Pathol，1997，151(3)∶821.

　　11，Bamford KB，et al.Lymphocytes in the human gastric mucosa during helicobacter pylori have a T helper cell 1 phenotype［J］.Gastroenterology，1998，114(3)∶482.

　　12，Akimoto M，et al.Relationship between recurrence of gastric ulcer and the microcirculation［J］.J Cardiovasc Pharmacol，1998，31 Suppl 1∶S507.

　　13，Berstad AE，et al.Epithelium related deposition of activated complement in helicobacter pylori associated gastritis［J］.Gut，1997，40(2)∶196.

　　14，Sakai N，et al.Low prevalence of Helicobacter pylori infection in patients with hamartomatous fundic polyps［J］.Dig Dis Sci，1998，43(4)∶766.

　　15，Berstad AE，et al.Helicobacter pylori gastritis and epithelial cell proliferation in patients with reflux oesophagitis after treatment with lansoprazole［J］.Gut，1997，41(6)∶740.

　　16，Hahm KB，et al.Augmented eradication rates of Helicobacter pylori by new combination therapy with lansoprazole，amoxicillin，and rebamipide［J］.Dig dis Sci，1998，43(2)∶235.

　　17，Konturek PC，et al.Epidermal growth factor and transforming growth factor alpha in duodenal ulcer and non-ulcer dyspepsia patients before and after helicobacter pylori eradication.Author［J］.Scand J Gastroenterol，1998，33(2)∶143.

　　18，Wu MS，et al.Genetic alternations in gastric cancer：relation to histological subtypes,tumor stages ,and Helicobacter pylori infection［J］.Gastroenterology1997,112(5)∶1457.

　　19，Wu MS，et al.Overpression of mutant P⁵³ and c-erbB-2 proteins and mutations of the P¹⁵ and P¹⁶ genes in human gastric carcinoma;with respect to histological subtypes and stages［J］.J gastroenterol Hepatpl，1998，13(3)∶305.

　　20，王小虎，等.胃Hp感染与癌前病变癌基因和抑癌基因表达的关系［J］.新消化病学,1998,6(6)∶516.

　　21，王金莹,等.胃粘膜病变中幽门螺杆菌感染与c-met基因表达相关性的分析［J］.中华消化杂志,1996,16(6)∶360.

　　22，高华,等.幽门螺杆菌相关性胃疾病抑癌基因¹⁶表达的研究［J］.中华消化杂志,1997,17(4)∶242.

　　23，Faller G，et al.Evidence of novel pathogenic pathways for the formation of antigastric autoantibodies in Helicobacter pylori gastritis［J］.J Clin pathol,1998,51(3)∶244.

　　24，Faller G，et al.Antigastric autoantibodies and gastric secretary function in Helicobacter pylori-infected patients with duodenal ulcer and non-ulcer dyspepsia［J］.Scand J Gastroenterol.1998，33(3)∶276.

　　25，周武庆,等.P物质对人多形核白细胞的影响［J］.中华微生物学和免疫学杂志,1998,18(2)∶124.