高三尖杉酯碱通过激活Caspase-3诱导T-淋巴细胞白血病细胞Molt-3凋亡

中国免疫学杂志 2000年第11期第16卷 肿瘤免疫学

作者：蔡真　林茂芳　Wolf-Dieter Ludwig　Leonid Karawajew　Zh ihai Qin

单位：蔡真 林茂芳(浙江大学医学院附属第一医院血液科，杭州 310003)；Wolf-Dieter Ludwig Leonid Karawajew(Department of Hematology, Oncology and Tumor Immunology, Robert-Rssle Clinic, Charit, Humboldt-University of Berlin, Germany)

　　关键词: T-淋巴细胞白血病细胞株；Molt-3；细胞凋亡；Caspase-3；FAS受体/配体

　　摘　要　目的：研究高三尖杉酯碱(HHT)诱导T-淋巴细胞白血病细胞凋亡的作用 机制 。方法：采用流式细胞仪等技术对HHT诱导T-淋巴细胞白血病细胞(Molt-3)的凋亡作 用进行探讨。结果：HHT诱导Molt-3凋亡，凋亡率与作用浓度和时间成正比；细胞被 阻 滞在G1期。HHT作用24 h后细胞内Caspase-3活性增高，Caspase-3 抑制剂Z-DEVD-FMK 能特 异地阻断HHT对Molt-3凋亡的诱导；Fas抗体可诱导细胞凋亡，但HHT对Fas受体/配体途径无 影响。结论： HHT对T-淋巴细胞白血病细胞的促凋亡作用和激活Caspase-3有关。

　　中国图书分类号　R392.12　R733.7

Homoharringtonine induced apoptosis in leukemic T-cells Molt-3 via activation of Caspase-3

CAI Zhen,LIN Mao-Fang

　　(Department of Hematology First Hospital of Zhejiang University,Oncology,and Tumor Immunology.)

　　Wolf-Dieter Ludwig et al.

　　(Robert-Roess le Clinic,Charité,Humboldt-University of Berlin,Germany)

　　Abstract　Objective:To explore the mechanism of HHT-induc ed apoptosis in l eukemic T-cells Molt-3.Methods:Flow cytometry ，colorimetric assay and RT -P CR were used to analyse the HHT-induced apoptotic pathways.Results:We stud i ed dose- and time-dependent effects of HHT on cell viability, cell cycle distr ib ution, Caspase-3 activity as well as expression of Fas on Molt-3 cells. In the se cells, HHT-induced apoptosis was associated with G1 delay and correlated wit h the activation of Caspase-3. Treatment with Caspase-3 inhibitor prevent HHT -in duced apoptosis significantly.Pretreatment of Mo lt- 3 cells with HHT did not increase the susceptibility to apoptosis induced by cro sslinking of Fas receptors. Furthermore, Fas-L neutralizing antibodies (Nok-1 an d -2) did not affect HHT-induced apoptosis in these cells.Conclusion: HHT in duced apoptosis in Molt-3 cells involves the activation of Caspase-3 .

　　Key words　T-cell line Molt-3　Apoptosis　caspase-3　Fas-receptor/li gand

　　细胞凋亡，又称程序性死亡，是细胞的一种生理性死亡过程。近年来研究表明它 在机体的许多生理病理过程中都起重要作用，多种抗癌药能诱导细胞凋亡。高三尖杉 酯碱( Homoharringtonine, HHT )是目前广泛用于临床治疗急性、慢性髓性白血病和骨髓 异常增生综合征 (MDS) 等的一线抗肿瘤药，而其对急性淋巴细胞白血病的治疗少见报 道。我们在体外实验发现HHT对T-淋巴细胞白血病细胞株有明显促凋亡作用 ，本文对其促凋亡机制作一探讨。

　　1　材料与方法

　　1.1　主要药物和试剂　高三尖杉酯碱 (1 mg/ml ) 购自杭州民生药厂, 用 RPMI稀释至所 需浓度, 保 存于4℃。Caspase-3抑制剂 Z-DEVD-FMK购自CALBIOCHEM公司; 抗兔FAS 多 克隆抗体系BIOMOL Research Laboratories Plymouth Meeting (PA USA) 公司产品；抗人F AS IgM抗体 (CH11, IgM) 购自Immunotech，Marseille ( France)公司，抗人FAS配体抗体 ( NOK1、NOK2) 购于Pharmigen (USA)，Annexin-V^FITC由Genzyme (Germany) 公司 提供。

　　1.2　细胞和细胞培养　①细胞系：人T-细胞白血病细胞株Molt-3来自 德国Braunschweig 细胞中心。②细胞培养：在5％CO₂，37℃条件下，用含10％小牛血清，青霉素(100 U/ml) , 链霉素 (100 μg/ml) 的PRMI1640培养液中培养传代，实验用细胞均处于对数生长期。

　　1.3　细胞凋亡和细胞周期检测　收集2 ×10⁵细胞经 PBS 洗涤后，Annexin-V^FITC 5 μl和碘化丙碇 ( PI, 10 μg/ml) 染色，避光作用1 0 min， 流式细胞仪检测；然后细胞用70％预冷的乙醇固定30 min，DNase-free RNA酶处理30 mi n ，加 PI (100 μg/ml) 染色后，分析10 000个细胞，检测细胞周期和亚二倍体峰的DNA含量 。

　　1.4　末端去氧核糖核酸片段标记 (TUNEL)　细胞用1％多聚甲醛固 定和0.1%TritonX-100处 理后，按照 (Boehringer Mannheim，Germany )公司提供的试剂盒( In Situ Cell Death D etection Kit，Fluorescein)的要求标记经HHT处理的细胞，流式细胞仪FACScan (Becton Dickinson公司)分析DNA荧光-dUTP标记后DNA片段断裂的程度。

　　1.5　流式细胞仪检测细胞APO表面抗原表达及抗APO/FAS和抗FAS配体作用 后的凋亡　经HHT 处理的细胞4×10⁵，PBS洗涤后，加20％小牛血清培养液封闭，直接加入抗APO^PE 抗体避光作 用30 min，流式细胞仪检测,结果分析采用相对荧光密度(Relative Fluorescence Intensit y , RFI )；CH11 和NOK1，NOK2各2 μl (100 ng/ml) 加入2×10⁵ ml^-1细胞的培 养孔内，于37℃、5％CO₂ 孵箱作用24 h后测凋亡。

　　1.6　半定量RT-PCR检测FAS-L mRNA表达　总RNA制备按Promega公司提 供的试剂盒建议的步骤操作：逆转录反应作用在42℃，持续30 min。50 μl 的PCR反应液含 有4 μl的逆 转录反应产物，10 μmol/L特异引物以及1 U Taq DNA多聚酶。在DNA扩增仪上进行：94℃变 性2 min后，循环 40 次 ( 94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 60 s)。然后取10 μl PCR产物 在1.5%凝胶上电泳，用DNA梯度标记 (Promega公司)。计算机Adoshop软件分析条带密度 ，内对照用GAPDH，基因表达强度是按 /GAPDH 的比率计算。 引物序列为：FAS-L fwd,5′-GGCAGAACTCCGAGAGCT-3′,rev,5′-CCAGAGAGA GCT CAGATACGT-3′,GAPDH fwd5′-CATCAGCAATGCCTCCTGCACC-3′，rev,5′-GTTG AAGTCAGAGGAGACCACC-3′。

　　1.7　Caspase-3活性测定及Caspase-3 酶抑制剂作用于HHT处理的细胞　 按Caspase-3 Colorimetric Assay Kit ( R & D System Inc)要求进行: 2×10⁶细胞溶于细胞溶解液50 μl后, 加入2×反应缓冲液50 μl和酶底物 (DEVD-pNA) 5 μl 37℃孵育1 h，用405 nm波长 分光光度仪(UV-1202, Shimadzu, Japan)测光密度 (O.D.)。在HHT作用细胞前2小时，预 加入100 μmol/L Z-DEVD-FMK。用流式细胞仪检测细胞凋亡是否受抑。

　　1.8　统计学分析　实验均用3复管，结果以均值±标准差表示；差异显 著性用配对t检验。

　　2　结果

　　2.1　HHT 诱导Mlot-3细胞凋亡　不同浓度的HHT（2、10、50 ng/ml) 分 别作 用于细胞6、12、18、24 h后，凋亡率随着剂量加大和时间延长而增加；显示有剂量 和时间依赖性(图1)，另外我们用末端去氧核糖核酸片段 标记(TUNEL)进一步来证实HHT诱导的细胞凋亡，可见细胞凋亡后产生末端标有荧光-dUTP的 D NA断裂片段，用流式细胞仪检测，标有荧光的DNA片段染色增强(图2 )。经不同浓度的HHT作 用24 h后分析HHT作用后细胞周期的变化(图3 )，Molt-3细胞在 HHT 10 ng/ml时就可见S、G2/M期减少，同时出现高尖的G1期峰，及至50 ng/ml, 随着凋 亡细胞的大量出现G1峰减少，表明凋亡耗尽了G1期存活的细胞；同时凋亡细胞的G1期增多， 增宽；HHT作用使细胞阻滞在G1期。

　　2.2　HHT不影响FAS配体/受体对Molt-3细胞的凋亡诱导作用　由于许多 抗肿瘤药物 促凋亡是通过FAS途径传递凋亡信号的^［1］。因此我们对Molt-3细胞的细胞表面F AS 受体表达用流式细胞仪进行检测。HHT 0、 2、10及50 ng/ml作用后细胞的相对荧光密度 (RFI，x±s )分别为22.67±1.150 0、34.00±1.730 0、32.67±1.15 0 0和22.670 0±0.577 4，无诱导 FAS表达增强作用；细胞经抗人FAS单抗CH11作用后，显示凋亡，但HHT对CH11无协同或增强 作用；FAS配体中和抗体 ( NOK1、2 ) 对HHT作用的细胞凋亡无任何阻断作用 (图4)。RT-PCR结果表明Molt-3细胞的FAS-L表达阴性，而且HHT无诱导FAS-L表达(资料 未显示)。

　　2.3　HHT通过激活Caspase-3诱导细胞凋亡　现认为Caspase 在 细胞凋亡过程中发挥重 要作用，尤其是Caspase-3是整个凋亡过程的一个重要环节， Z-DEVD-FMK是Caspase-3 酶的特异性抑制剂。取经HHT作用后24 h的细胞上清液测得的Caspase-3 的活性 ，在 HHT 10 ng/ml和50 ng/ml水平，可观察到 Molt-3细胞的Caspase 酶的活性随着剂量加大而 增高 (图5)，提示Caspase-3在Molt-3细胞的凋亡过程 被激活；进一步用 Z-DEVD-F MK先于HHT与细胞作用，2 h后加入HHT继续作用20 h，用流式细胞仪测凋亡, 发现Caspase-3抑制剂能抑制Molt-3细胞的凋亡(图6)。

图1　HHT诱导Molt-3细胞凋亡具时间和剂量依赖性

　　Fig.1　HHT induced Molt-3 cells apoptosis:does-and time-dependent

图2　末端去氧核糖核酸片段标记表明HHT 处理后的细胞荧光强度增加

　　Fig.2　TUNEL assay showed flurorence increased after HHT-treated Molt-3

图3　细胞经HHT作用后细胞周期表示G1期受 阻

　　Fig.3　Cell cycle showed G1 phase arrested

图4　Fas受体/配体不影响HHT诱导的Molt-3细胞凋亡

　　Fig.4　Fas-receptor/ligand didn't effect on HHT-induced Molt-3 apo ptosis

　　Note:P＜0.001(^* vs.+),P＞0.05(+ vs.#)

图5　HHT处理后的细胞Caspase-3活性增加

　　Fig.5　Caspase-3 activity increased after HHT-treated

图6　Caspase-3抑制剂能抑制HHT诱导Molt-3细胞凋 亡Fig.6　Caspase-3 inhibitor can inhibit HHT-induced Molt-3 apotosis

　　Note：P＜0.001(^* vs +)

　　3　讨论

　　HHT是临床常用的抗白血病化疗药物^［2］。主要用于治疗急性初发、复发髓性 白 血病、慢性髓性白血病急变期。对治疗急性淋巴细胞白血病尚少见报道。以往研究表明 HHT抑制细胞内蛋白合成，而对DNA、RNA的影响甚微^［3］。亦有报道HHT在体内与其 他化疗药物如阿糖胞苷或α-干扰素单用或联合应用能诱导慢性粒细胞白血病细胞凋亡；体 外有促进HL-60 细胞凋亡现象^［2,4］。

　　细胞凋亡是生命活动中重要的细胞学事件，是细胞对内外刺激信号作出的应答反 应，近年来的研究表明它在机体的许多生理病理过程中都起重要的作用。调控凋亡的 机制很多，其中对化疗药物诱导促凋亡的研究比较多的是通过Fas-配体/受体途径 ^［1］。因为Fas在急性白血病细胞的表达率很高^［5］，本文中研究的Molt-3 细胞表面虽然表 达Fas蛋白，并且抗Fas抗体( CH11)可导致细胞发生凋亡，说明Fas受体/配体途径介导 细胞凋亡, 但HHT作用不影响细胞Fas受体和配体的表达强度，并无诱导Fas受体和配 体产生的作用。

　　现认为诱导凋亡的发生最终可能涉及到一种依赖天门冬氨酸的半胱氨酸酶，称之 为Caspase的酶^［6］。至今为止，已有编码10余种Caspase酶的cDNA被克隆。所有的C asp ase酶都以非活性形式合成，然后以亚单位形式激活后释放，在凋亡过程中Caspase-3 是 Caspase酶联反应的终末因子 ( terminal member )。Caspase的功能在于溶解细胞(effecto r 效应功能)和启动细胞对凋亡信号 (initiator, 启动作用)的反应^［7］。激活的Cas pase-3 裂解 细胞的关键结构蛋白和看家蛋白，如涉及到DNA修复的poly(ADP ribose) polymerase (PARP)，DNA依赖的蛋白激酶，蛋白激酶C和U1小核蛋白酶。其上游因子可能是线粒 体。目前认为线粒体在调节细胞凋亡中也具有重要的作用^［8，9］，机理是通过改变 细胞线粒 体的还原-氧化电位、释放激活Caspase的蛋白如线粒体呼吸链蛋白细胞色素c从线粒体释放 到胞浆，激活Caspase-3或通过其上游的Caspase 8、9 起作用^{［10，11］}。Caspas e-3目前在 Caspase家族中已认为在经多种诱导剂刺激后导致凋亡的关键酶。本文研究结果表明HHT作用细胞后， Caspase-3的活性增加，同时能被Z-DEVE-FM K部分抑制。

　　由此可见，Caspase-3参与HHT诱导的Molt-3细胞凋亡。其激活Caspase酶通路 有可 能通过Fas旁路进行。有关HHT促凋亡的其他信号传导途径，尚待进一步研究。同时由于HHT 对T-淋巴细胞有促凋亡作用，这将对扩大HHT的临床应用范围提供了实验依据。

　　作者简介：蔡真，女，38岁，副主任医师，博士生，主要从事血液病临床医疗，主要研究原癌基因对白血病发病机理的影响，调控和化疗药物对白血病细胞的促凋亡机制等

　　Zh ihai Qin(Max-Delbrk-Center for Molecular Medicine, Berlin, Germany)

　　参考文献

　　1，Friesen C， Herr I， Krammer P H et al. Involvement of t he CD95(APO/FAS) recept or/ligand system in drug- induced apoptosis in leukemia cells. Nat Med，1996; 2: 574

　　2，Visani G， Russo D, Ottaviani E et al. Effect of homoharringtonine alone and i n combination with alpha interferon and cytosine arabinoside on "in vitro" growt h and induction of apoptosis in chronic myeloid leukemia and normal hematopoieti c progenitors. Leukemia, 1997 ; 11(5):624

　　3，Zhou J Y， Chen D L， Shen Z S et al. Effect of homoharringtonine on p rolifera tion and differentiation of human leukemic cell in vitro. Cancer Res，1990; 50: 2031

　　4，Li L， Xia L J， Jiang C et al. Induction of apoptosis by harringtonine and homoharringtonine in HL-60 cells. Yao-Hsueh-Hsueh-Pao，1994; 29(9): 667

　　5，Munker R， Lüert M， Yonehara S et al. Expression of the Fas antigen on primary human leukemia cells. Ann Hematol，1995; 70: 15

　　6，Wickremasinghe R G， Hoffbrand A V. Biochemical and genetic control of apopt os is: relavance to normal hematopoiesis and hematological malignancies. Blood, 1999; 93: 3587

　　7，Thornberry N A， Lazebnik Y. Caspase: enemies within. Science, 1998; 281: 1312

　　8，Roemer G， Zamzami N， Susin S A. Mitochondial control of apoptosis. Immun ol Today，1997; 18: 44

　　9，Douglas R G， John C R. Mitochondria and apoptosis. Science，1998; 281 :1309

　　10，Li P， Nijhawan D， Budihardjo I et al. Cytochrome c and dATP-depend ent fo rmation of Apaf-1/Casppase 9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell， 1997; 91: 479

　　11，Liu X， Kim C N， Yang J et al. Induction of apoptotic program in cell fr ee extracts: requirement for dATP and cytochrome c. Cell，1996; 86: 147

［收稿2000-03-08　修回2000-05-09］