血吸虫重组卡介苗-Sj26GST疫苗的构建及免疫原性的研究
中华医学杂志2000年第80卷第6期
戴五星 皇甫永穆 郑波 程继忠 黄翠华 黄海浪
摘 要 目的 构建含日本血吸虫相对分子质量为26000的抗原(Sj26GST)基因的重组卡介菌（rBCG）疫苗,观察其对BALB/c小鼠的免疫保护作用。方法 采用分子生物学技术,将Sj26GST cDNA克隆到人结核杆菌热休克蛋白(HSP)70启动子下游,构成融合基因,再将此融合基因亚克隆到E.coli-分枝杆菌穿梭质粒pBCG-2000中,构成重组质粒pBCG-Sj26,然后转化卡介苗(BCG),构成血吸虫重组BCG-Sj26GST(rBCG-Sj26GST)疫苗,经热诱导,在BCG中表达Sj26GST抗原。用rBCG-Sj26GST疫苗皮下免疫BALB/c小鼠,以淋巴细胞刺激指数(SI)反映细胞增殖能力,以NO释放量检测巨噬细胞吞噬活性,以ELISA试剂盒检测血清及脾淋巴细胞培养上清的白细胞介素（IL)-2和干扰素（IFN)-γ的含量。结果 HSP70启动子与Sj26GST cDNA融合基因已被克隆到pBCG-2000穿梭表达质粒中,相对分子质量为26000处可见明显的表达蛋白带, 其表达量占菌体总蛋白量的15%。rBCG-Sj26GST疫苗以106菌落形成单位（CFU）经皮下免疫小鼠后,其脾SI为2.26±0.43，与对照组（1.61±0.28），载体组（1.48±0.30）和BCG组（1.42±0.26）比较，P＜0.05;巨噬细胞NO的含量为357 nmol/ml±84 nmol/ml，与对照组（183 nmol/ml±33 nmol/ml)和载体组（203 nmol/ml±56 nmol/ml)比较，P＜0.01；小鼠血清IL-2的含量为267 pg/ml±130 pg/ml，高于对照组（45 pg/ml±15 pg/ml，P＜0.01)和载体组（52 pg/ml±29 pg/ml，P＜0.05）;小鼠血清IFN-γ和脾淋巴细胞培养上清IL-2的含量分别比对照组增高20%和44%,均有升高趋势。结论 重组的Sj26GST基因能在BCG中高效表达;rBCG-Sj26GST疫苗具有较强的免疫原性,能明显增强BALB/c小鼠的免疫应答反应。
关键词：血吸虫，日本 疫苗，合成 基因表达
血吸虫病是世界上严重危害人类健康的主要寄生虫病之一,因此世界卫生组织已把发展血吸虫病疫苗作为首要目标［1］。在血吸虫所具有免疫保护作用的候选抗原中,尤以日本血吸虫相对分子质量为26000和曼氏血吸虫相对分子质量为28 000的抗原分子更加引人注目。我们采用分子生物学技术,将日本血吸虫相对分子质量为26000抗原基因克隆入大肠杆菌一分枝杆菌穿梭质粒pBCG- 2000中,转化卡介苗(BCG),构成日本血吸虫重组BCG疫苗,并用此疫苗免疫BALB/c小鼠,为阐明此疫苗抗感染的机制提供实验依据。
材料与方法
一、材料
1.实验动物:雄性BALB/c小鼠,体重18 g±1 g,购自本校实验动物中心。
2.菌种、质粒、工具酶、引物及主要试剂:E.coli DH5α为本室收藏;质粒pBCG-2000为本室构建;BCG丹麦株,为北京生物制品研究所提供;质粒pGEX(含日本血吸虫菲律宾株Sj26GST全长cDNA序列)由美国Wang博士赠送;质粒pMT70(含人结核杆菌热休克蛋白70的启动子序列)由英国DB Lowrie提供;Middle brook 7H9 Broh(M7H9) 培养基(0713-17-9)和Middle Brook ADC Enrichment(0714-62)均购自美国Difco公司;刀豆素A(ConA)、小牛血清、DNA限制性内切酶、修饰酶、dNTP以及DNA和蛋白质相对分子质量标准均购于北京华美生物工程公司;RPMI-1640购于美国Sigma公司;MTT购于瑞士Fluka公司;白细胞介素(IL)-2、干扰素(IFN)-γ检测试剂盒购于美国Endogen公司;HSP启动子和Sj26GST基因寡核苷酸引物分别由上海Sangon生物工程有限公司和本校分子生物学开放实验室合成。
二、方法
1.HSP70启动子和Sj26GST基因的PCR扩增:首先合成两对寡核苷酸引物:（1）5′-TACGAA-TTCTAGACCGCACG-3′;（2）5′-CCCGACCGCAGGATC-CATGGTG-3′;（3）5′-CCGCTGCAGATGTCCCCTATA-CTAGGTTAT-3′;（4）5′-GTCGTCGACTTATTTTGGAGG-ATGGTCGC-3′。以（1)、（2）为引物,质粒 pMT-70为模板合成长度约为150 bp的HSP70的启动子片段;以（3）、（4）为引物,质粒pGEX为模板合成654 bp的Sj26GST全长cDNA序列。
2.重组DNA技术：参照文献［2］。
3.分枝杆菌的培养、转化与诱导表达：参照文献［3］。
4.SDS-PAGE及蛋白质密度扫描:BCG在生长至对数生长期时(需4周左右),收菌前3 d,每天45℃热诱导45 min,然后离心收获细菌,将BCG悬浮于预冷的磷酸盐缓冲液中,进行超声粉碎,取20μl用于聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,考马斯亮蓝染色。SDS-PAGE结果用图像分析系统和岛津薄层扫描仪在波长560 nm处扫描分析。
5.动物免疫:雄性BALB/c小鼠28只,随机分成4组,每组7只。第1组为空白对照组,每只鼠皮下注射生理盐水0.1 ml;第2组为空载体组,每只鼠皮下注射含pBCG-2000质粒(不含HSP70启动子和相对分子质量为26000 GST cDNA)的重组耻垢分枝杆菌0.1 ml(106CFU);第3组为BCG组,每只鼠皮下注射BCG0.1 ml(106CFU);第4组为实验组,每只鼠皮下注射重组卡介苗(rBCG)-Sj26GST疫苗0.1 ml(106CFU)。免疫8周时,断头处死小鼠,取血、取腹腔巨噬细胞和脾脏进行试验。
6.淋巴细胞转化试验与巨噬细胞NO的测定：参照文献［4］进行。
7.IL-2及IFN-γ的测定:断头取血分离血清,鼠脾淋巴细胞IL-2及IFN-γ的诱生培养参照文献［5］进行。采用ELISA试剂盒测定IL-2和IFN-γ,按说明书操作,在DG3022酶标仪于波长450 nm测A值,检测标准品,血清及脾淋巴细胞培养上清标本。以标准品的吸光度对浓度绘制标准曲线,求血清及淋巴细胞培养上清中IL-2及IFN-γ的含量。
8.统计学处理:差异显著性检验采用t检验。
结果
一、rBCG-Sj26GST疫苗的构建及鉴定
如图1所示,将编码Sj26GST的cDNA片段按正确的方向克隆入质粒pMT-70人结核杆菌HSP70启动子下游,然后再将HSP70启动子和目的基因一起克隆到pBCG-2000中,构成能在大肠杆菌一分枝杆菌表达的pBCG-Sj26质粒。为说明重组体中含有正确连接的 hSP70启动子与Sj26GST基因,且大小与理论值一致,以引物（1）、（4）为引物,质粒pBCG -Sj26为模板,经PCR扩增合成长度为800 bp左右HSP70-Sj26GST cDNA片段(图2)。表明HSP70启动子与Sj26GST cDNA融合基因已被克隆到穿梭表达质粒中。将pBCG-Sj26质粒转化到BCG中表达,表达的Sj26GST蛋白占BCG总蛋白的15%(图3)。
E：EcoR Ⅰ；S：Sal Ⅰ；Sm：Sma Ⅱ；Xh：XhoⅠ；P：Pst Ⅰ；N：Nco Ⅰ；X：Xba Ⅰ；B：BamH Ⅰ；Ev：EcoRV；H：HindⅡ；K：Kpn Ⅰ；Sc：Sca Ⅰ；Bg：Bgl Ⅰ；Hp：Hpa Ⅰ；Sa：Sac Ⅰ；OriE：大肠杆菌质粒复制起始点；OriM：分枝杆菌质粒复制起始点；Phsp70：人结核杆菌Hsp70启动子；GST：谷胱甘肽S转移酶图1 大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG-Sj26的构建
二、rBCG-Sj26GST疫苗对小鼠淋巴细胞转化功能及巨噬细胞吞噬活性的影响
由表1可见，用rBCG-Sj26GST疫苗按106 CFU经皮下注射免疫BALB/c小鼠,其脾淋巴细胞刺激指数（SI）为2.26±0.43，与对照组（1.61±0.28），载体组（1.48±0.30）和BCG组（1.42±0.26）相比，差异具有显著意义（P＜0.05）；rBCG-Sj26GST组巨噬细胞释放的NO明显高于对照组和载体组(P＜0.01),与BCG组相比,其含量虽差异无显著意义(P＞0.05),但仍增高35%。
1.分子量标准；2、3.HSP70启动子；4、5.Sj26GST基因；6、7.HSP70启动子与Sj26GST基因图2 日本血吸虫26KuGST基因PCR产物电泳结果
1.分子量标准；2.E.coli DH5α菌体总蛋白；3.Ecoli dH5α(含pGEX)经IPTG诱导后的菌体总蛋白；4.BCG(含pBCG-2000)经热诱导后破菌沉淀部分的蛋白；5.BCG(含pBCG-Sj26)经热诱导后破菌沉淀部分的蛋白；6.BCG(含pBCG-2000)经热诱导后破菌上清部分的蛋白；7.BCG(含pBCG-Sj26)经热诱导后破菌上清部分的蛋白图3 Sj26GST基因在BCG中表达产物的
sDS-PAGE图谱
三、rBCG-Sj26GST疫苗对小鼠血清及脾淋巴细胞培养上清IL-2及IFN-γ含量的影响
经rBCG-Sj26GST疫苗免疫的小鼠,其血清IL-2的浓度为267 pg/ml±130 pg/ml，明显高于对照组(45 pg/ml±15 pg/ml，P＜0.01)和载体组（52 pg/ml±29 pg/ml，P＜0.05),脾淋巴细胞培养上清IL-2的浓度为264 pg/ml，较对照组（184 pg/ml）高44%,较载体组（178 pg/ml）高48%，较BCG组（185 pg/ml）高42%,但差异无显著意义(P＞0.05)(表2);血清IFN-γ的浓度为1970 pg/ml,较对照组（1 645 pg/ml）高20%，较载体组（1 649 pg/ml）高19%，较BCG组（1738 pg/ml）高13%,但差异无显著意义(P＞0.05)(表3) 。
表1 rBCG-Sj26GST疫苗对小鼠脾淋巴细胞转化功能和腹腔巨噬细胞活性的影响(x±s)
| 组 别 |
鼠数 |
刺激指数 |
NO(nmol/ml) |
| 对照组 |
7 |
1.61±0.28 |
183±33 |
| 载体组 |
7 |
1.48±0.30 |
203±56 |
| BCG组 |
7 |
1.42±0.26 |
264±141 |
| rBCG-Sj26GST组 |
7 |
2.26±0.43* |
357± 84△▲ |
注：与对照组、载体组和BCG组比较*t=2.46,2.75, 2.93，P＜0.05；与对照组和载体组比较△t=5.11,4.03，P＜0.01；与BCG组比较▲t=1.50，P＞0.05
表2 rBCG-Sj26GST疫苗对小鼠血清和脾淋巴细胞培养上清白细胞介素-2的影响(pg/ml，x±s）
| 组 别 |
鼠数 |
血清白细胞
介素-2 |
培养上清
白细胞介素-2 |
| 对照组 |
7 |
45± 15 |
184±141 |
| 载体组 |
7 |
52± 29 |
179± 99 |
| BCG组 |
7 |
189±121 |
185±120 |
| rBCG-Sj26GST组 |
7 |
267±130* |
264±181△ |
注：与对照组比较*t=3.16，P＜0.01；△t=0.92，P＞0.05；与载体组比较*t=3.03，P＜0.05；△t=1.02,P＞0.05；与BCG组比较*t=0.94，P＞0.05；△t=0.95，P＞0.05
表3 rBCG-Sj26GST疫苗对小鼠血清干扰素-γ含量的影响(pg/ml，x±s）
| 组 别 |
鼠数 |
血清干扰素-γ |
| 对照组 |
7 |
1 645±201 |
| 载体组 |
7 |
1 649±348 |
| BCG组 |
7 |
1 738±199 |
| rBCG-Sj26GST组 |
7 |
1 970±331* |
注：与对照组、载体组和BCG组比较*t=2.13,1.69, 1.56，P＞0.05讨论
BCG以其免疫佐剂作用强、安全,被认为是发展成为一种活重组疫苗的理想载体,近年科学家们已将多种外源基因导入BCG中表达［6］。但要使外源基因在BCG中表达,首要条件是所用表达质粒含有能被分枝杆菌DNA依赖的RNA聚合酶所识别的启动子。人结核杆菌HSP70启动子是一种高效可控启动子,在受到热及过氧化物等处理时能启动其下游基因的转录,而且当BCG在体内被巨噬细胞吞噬后,可活化HSP70启动子。我们在构建rBCG-Sj26GST疫苗时也选用了人结核杆菌HSP70启动子。结果证明,这种启动子能启动Sj26GST基因在BCG中高效表达,表达的Sj26GST蛋白占菌体总蛋白的15%左右。
重组的BCG疫苗接种后,通过补体和单核巨噬细胞表面甘露糖受体结合而被吞噬,并在其中生存和复制,表达重组的Sj26GST抗原和BCG自身蛋白,分泌或释放到吞噬体内,经抗原提呈细胞(APC)提取处理后,形成的抗原肽-MHCⅡ类分子或抗原肽-MHCⅠ类分子复合物被高尔基体运送到APC表面,分别供CD4+或CD8+T细胞的TCR识别,许多CD分子和粘附分子也参与抗原提呈与信息传递过程。T细胞活化后,增殖分化形成效应性 th细胞,其中Th1分泌IL-2和IFN-γ在细胞介导的免疫中发挥作用,IL-2和IFN-γ能增强抗原递呈过程,内源性IFN-γ可促使T细胞分化为Th1细胞,产生更多的IFN-γ,起到一种正反馈调控作用。而Th2则分泌IL-4、IL-5和IL-10，在抗体的产生中发挥作用［7］。本结果显示,用rBCG-Sj26GST疫苗以106CFU的剂量经皮下免疫BALB/c小鼠后,血清IL-2的含量明显高于对照组和载体组,与BCG组相比较差异无显著意义；脾淋巴细胞培养上清IL-2的含量分别较对照组高44%,较载体组高48%，较BCG组高42%；血清IFN-γ的浓度较对照组高20%,较载体组高19%，较BCG组高13%。提示，rBCG-Sj26GST疫苗能有效刺激宿主细胞产生IL-2和IFN-γ。
近年的研究表明,巨噬细胞产生的NO在抗感染中起着重要作用。IFN-γ、IL-1、 iL-2、TNF-α、GM-CSF以及LPS、BCG等均可单独或联合刺激巨噬细胞产生NO。NO及其衍生物统称为活性氮介质,在多种抗感染和非特异性免疫中发挥作用［7］。本结果显示,rBCG-Sj26GST疫苗可明显增高BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞NO的含量(P＜0.01)。表明巨噬细胞的吞噬活性明显增强,有利于杀灭病原体。
基金项目：总理基金(94-Y-19)和国家自然科学基金(39480022)资助项目
作者单位： 戴五星（武汉，同济医科大学实验医学研究中心医学分子生物学研究室 430030)
皇甫永穆（武汉，同济医科大学实验医学研究中心医学分子生物学研究室 430030)
郑波（武汉，同济医科大学实验医学研究中心医学分子生物学研究室 430030)
程继忠（武汉，同济医科大学实验医学研究中心医学分子生物学研究室 430030)
黄海浪（武汉，同济医科大学实验医学研究中心医学分子生物学研究室 430030)
黄翠华（武汉市白沙洲医院）
参考文献
1，Bergquest NR. Controlling schistosomiasis by vaccination: a realistic option? Parasitology Today,1995,11:191-194.
2，Sambrook J, Fritsch EF, Mantiatis T. Molecular Cloning, a Laboratory Mannual. new York: Cold Spring Harbor laboratory, 1987,97-148.
3，Lowrie DB, Tascon RE, Silva CL. Vaccination against tuberculosis. international rchives of Allergy and Immunology. Switzerland, 1995, 108:309-312.
4，程继忠,郑波,肖红,等.结核杆菌HSP70在耻垢分枝杆菌中的表达及其免疫原性研究.中华微生物学和免疫学杂志,1998,18:337-341.
5，沈关心,周汝麟.现代免疫学实验技术.武汉:湖北省科学出版社,1998.261,277.
6，Murray PJ, Aldovini A, Young RA. Manipulation and potentiation of antimycobacterial immunity using recombinant bacille Calmette- Guerin strains that secrete cytokines. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:934-939.
7，Yang J, Mitsuyama M. An essential role for endogenous interferon-γ in the genenation of protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. immunology, 1997,91:529-535.
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