日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30对山羊的保护性免疫作用
中华医学杂志2000年第80卷第6期
冯振卿 李玉华 仇镇宁 李芸茜 王祝鸣 刘宁波 李祥瑞 许立新 吴观陵 管晓虹
摘 要 目的 观察日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30主动免疫对山羊的保护性免疫作用。方法 将22只山羊随机分为两组：(1)实验组：12只，每只山羊NP30的免疫剂量为1000 μg/次，后腿肌肉注射，连续免疫3次，最后1次免疫后8周进行尾蚴攻击。(2)对照组：10只，肌肉注射SP2/0腹水。尾蚴攻击感染后第12周处死。结果 NP30主动免疫山羊可诱导42.78%的减虫率，肝组织减卵率为35.83%，粪减卵率为25%，并可明显抑制肝脏虫卵肉芽肿的大小，肉芽肿数量明显减少，体重增加。结论 NP30主动免疫山羊对尾蚴攻击可产生较好的保护作用。
关键词：血吸虫，日本 抗体,抗独特型 山羊
我们以往的研究业已证实，日本血吸虫单克隆抗独特型抗体(anti-id)NP30系肠相关抗原(GAA)的内影像anti-id，具有模拟抗原的功能，可替代虫源性抗原用于血清学诊断［1］。用NP30主动免疫小鼠可诱导50.46%的保护力，可使雌虫子宫内虫卵数减少38.55%，肝组织内成熟虫卵下降66.63%，死亡虫卵增加60.66%［2，3］。另外，还证明NP30对虫卵肉芽肿和肝纤维化有明显的负调节作用，可减轻日本血吸虫对宿主造成的免疫病理损害［4］，提示NP30主动免疫小鼠具有抗感染免疫和抗病免疫的双重功能。为探索NP30对家畜的保护作用，我们观察了NP30对山羊的保护性免疫。现报道如下。
材料与方法
一、材料
1．实验动物：淮山羊22只，雌12只， 雄10只。3～4月龄，体重13 kg±2.4 kg，购自非血吸虫病疫区南京市江浦县星甸镇山区。经粪检和血清学检测，血吸虫卵和抗体均为阴性。试验前每只山羊口服Zentel（商品名史克肠虫清，中美史克公司生产）400 mg驱虫。试验期间在南京农业大学动物医学院饲养场舍饲，给予营养平衡的精饲料。
2．单克隆抗独特型抗体NP30：NP30杂交瘤细胞株的建株见管晓虹等报道［1］。NP30杂交瘤细胞培养上清，经饱和硫酸铵沉淀蛋白质，用磷酸盐缓冲液调节其质量浓度为10.0 g/L，-70℃保存备用。
3．动物分组及实验程序：实验程序参照文献［2］。实验动物分为两组：(1)NP30免疫组：12只山羊，连续免疫3次，每只山羊NP30的免疫剂量为1000 μg/次，后腿肌肉注射，免疫间隔时间为2周。第3次免疫之后8周进行尾蚴攻击（阳性钉螺购自江苏省血吸虫病防治所），每只山羊经后腿耻部皮肤感染300条±5条尾蚴。尾蚴攻击感染后第12周处死。(2)SP2/0对照组：10只山羊，以小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）腹水代替NP30，其他处理同NP30免疫组。
二、方法
1．收集成虫：处死山羊后，暴露胸腔、腹腔，采用门静脉灌注法冲洗收集虫体计数，分别计数雄虫、雌虫及合抱虫数。按下列公式计算减虫率。
减虫率=(1-(实验组收获成虫数)/(对照组收获成虫数))×100％
2．肝组织虫卵定量：称取肝组织（右叶）2 g，剪碎，置于小烧杯中，加入50 g/L的KOH 20 ml，于37℃孵箱中消化12 h（过夜），直至组织消化完全，搅匀，用微量移液器吸取100μl，涂片4张，加盖玻片在显微镜下计数全部4张涂片虫卵数，再乘以100，即为虫卵数/g肝组织(EPG)。以EPG值乘以每只山羊的肝脏重量，即为肝脏虫卵总数。
3．肝虫卵肉芽肿定量：在山羊肝脏左、中、右叶分别取3块厚约2 mm的组织，体积分数为10%甲醛固定，石蜡包埋，切片厚约4～5μm，HE染色。应用NYD-1000型医学图像分析系统（南京医科大学与东南大学联合研制）测量切片中所有含完整毛蚴的单虫卵肉芽肿面积，用标准计算纸测量肝组织面积，全部数据输入计算机，计算以下指标：(1)虫卵肉芽肿大小：包括虫卵肉芽肿截面面积（mm2/个）和体积(mm3/个)［5］；(2)虫卵肉芽肿数量：即单位面积或单位体积肝组织内虫卵肉芽肿的数量（个/cm2、个/cm3)。
4．粪卵定量：解剖前收集山羊粪便，称取粪1 g，先后经铜筛、150目和260目尼龙筛集卵，再用生理盐水定体积至5 ml，搅匀，每个粪样用微量移液器吸取100 μl，涂片4张，加盖玻片在显微镜下计数全部虫卵数，将4张涂片的虫卵数相加，再乘以50 ePG。
5．统计学处理：两组均数差异显著性检验采用t检验。
结果
1．肝脏表面虫卵结节大体观察：SP2/0对照组肝脏表面虫卵结节较大、分布密集(图1，2)，NP30免疫组肝脏表面虫卵结节较小、分布稀疏(图3，4)。
2．减虫率：NP30免疫组和SP2/0对照组检获成虫数及合抱成虫数见表1。
表1 两组山羊成虫检获情况
| 组别 |
山羊数
(只) |
成虫数
(x±s) |
减虫率
(%) |
合抱成虫数
(x±s) |
合抱减
虫率(%) |
| NP30 免疫组 |
12 |
56±32 |
42.78* |
16±12 |
48.97* |
| SP2/0对照组 |
10 |
98±34 |
… |
31±11 |
… |
注:两组比较*t=3.01，2.94；P＜0.01；…为无此数据(表2～4同) 3．肝组织内虫卵数量：尾蚴攻击感染后第12周，肝组织内虫卵EPG及虫卵总数见表2。
表2 两组山羊肝组织内EPG及虫卵总数
| 组别 |
山羊数 (只) |
肝脏虫卵数
(x±s) |
减卵率
(%) |
肝脏虫卵总数
(×106，x±s) |
减卵率
(%) |
| NP30 免疫组 |
12 |
15 767± 7 672 |
35.83* |
5.4±2.9 |
41.00** |
| SP2/0对照组 |
10 |
24 570±23 574 |
… |
9.1±9.6 |
… |
注:两组比较*t=2.23，P＜0.05；**t=2.88，P＜0.01；EPG为虫卵数/g肝组织 4．肝虫卵肉芽肿大小、数量：肝虫卵肉芽肿大小、数量见表3，4。
表3 两组山羊肝虫卵肉芽肿面积和体积
| 组别 |
山羊数 (只) |
肉芽肿面积
(mm2/个，x±s) |
抑制率
(%) |
肉芽肿体积
(mm3/个，x±s) |
抑制率
(%) |
| NP30 免疫组 |
12 |
0.07±0.07 |
49.71* |
0.030±0.012 |
65.60* |
| SP2/0对照组 |
10 |
0.14±0.16 |
… |
0.087±0.036 |
… |
注：两组比较*t=3.11，3.08；P＜0.01
表4 两组山羊肝虫卵肉芽肿数量
| 组别 |
山羊数 (只) |
单位面积
肉芽肿数量
(个/mm2，x±s) |
抑制率
(%) |
单位体积
肉芽肿数量
(个/mm3，x±s) |
抑制率
(%) |
| NP30 免疫组 |
12 |
6.3±2.6 |
56.85** |
145± 57 |
40.64* |
| SP2/0对照组 |
10 |
14.7±8.3 |
… |
245±142 |
… |
注：两组比较*t=2.44，P＜0.05;**t=2.97，P＜0.01 5．粪卵计数：尾蚴攻击感染后第12周，NP30免疫组的EPG为113±100，SP2/0在对照组为150±88，减卵率为25％(P＜0.05)。
6.体重的改变：在实验开始前及动物处死前分别称其体重，NP30免疫组每只山羊体重增加2.8 kg±1.8 kg，SP2/0对照组山羊体重增加1.1 kg±1.4 kg，两组比较P＜0.01。
讨论
以灭螺和化疗为主的血吸虫病综合防治虽可有效地控制发病，但不能阻断其传播。因此，发展疫苗是控制血吸虫病的重要措施［6］。动物种属不同，遗传背景不同，对血吸虫的易感性也有很大差异。有些血吸虫病疫苗候选分子对啮齿类动物（如小鼠）具有很好的保护作用，但对家畜（如羊、耕牛）却无相似的保护作用。所以有必要在不同种类的动物，尤其是在家畜进一步研究候选疫苗分子对宿主的保护作用［7］。羊是血吸虫病流行区的重要保虫宿主，所以我们以山羊作为实验动物，研究日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30对羊的保护性免疫作用。
图1，2 SP2/0对照组肝脏表面虫卵结节密布图3，4 NP30免疫组肝脏表面虫卵结节稀疏
本结果表明，NP30主动免疫山羊，减虫率可达42.78%，同时发现合抱成虫对数减少48.97%，说明NP30主动免疫可产生较好的保护作用，并可抑制雌雄虫合抱，降低雌虫成熟程度，减少产卵。NP30免疫组肝组织内EPG低于SP2/0对照组，减卵率为35.81%，如果从肝脏虫卵总数来看，其减卵率可达41.00%。NP30免疫组肝虫卵肉芽肿的面积和体积均较SP2/0对照组降低，提示NP30主动免疫对虫卵肉芽肿具有较强的负调节作用。由于肝脏的血吸虫卵明显减少，故NP30免疫组肝脏虫卵肉芽肿的数量也明显减少，这对于减轻宿主肝脏病理损害，降低病畜死亡率将起到一定作用。从粪卵来看，NP30免疫组粪卵较SP2/0对照组轻度减少（减卵率为25%)。减卵率虽然较低，但对于减少虫卵对环境的污染，降低人畜相互感染具有一定意义。本结果提示，NP30主动免疫对山羊血吸虫感染具有抗感染保护作用和抗病免疫的双重功效，进一步验证了应用小鼠获得的实验结果。本研究可为血吸虫病提供一种新型疫苗─—anti-id疫苗，对流行区大家畜的血吸虫病防治将产生巨大推动作用。
另外，本文还发现NP30免疫组山羊体重增加幅度明显高于SP2/0对照组，说明NP30主动免疫产生了较好的保护作用，可以明显提高畜牧业的经济效益。
基金项目：江苏省科委社会发展基金资助项目(BS97036)
作者单位：冯振卿（南京医科大学病理学教研室 210029)
李玉华（南京医科大学病理学教研室 210029)
刘宁波（南京医科大学病理学教研室 210029)
仇镇宁（寄生虫学教研室)
李芸茜（寄生虫学教研室)
王祝鸣（寄生虫学教研室)
吴观陵（寄生虫学教研室)
管晓虹（寄生虫学教研室)
李祥瑞（南京农业大学动物医学院)
许立新（南京农业大学动物医学院）
参考文献
1，管晓虹, 仇镇宁, 马磊,等. 日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30的建株及初步鉴定.中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 1991,9:261-264.
2，冯振卿，仇镇宁，李玉华，等.日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30诱导保护性免疫.上海免疫学杂志, 1997,17:276-278.
3，冯振卿，李玉华，仇镇宁，等.日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30诱导抗卵免疫的研究.中国人兽共患病杂志, 1999,15:17-20.
4，朱荣，冯振卿，李玉华，等.日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30对血吸虫病肝纤维化的调节作用.中国寄生虫病防治杂志，1999，12:222-225.
5，Campbell HA, Pitot HC, Potter VR, et al. Application of quantitative sterelogy to the evaluation of enzyme-altered foci in rat liver. Cancer Res,1982,42:465-472.
6，姜小山,赖建平. 血吸虫疫苗的研究现状与展望.中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 1997,15:111-116.
7，林矫矫，田锷，叶萍，等.抗独特型抗体预防绵羊日本血吸虫病试验. 中国兽医科技,1995,25:23-25.
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