日本血吸虫大陆株脂肪酸结合蛋白SjFABPc编码区基因的体外扩增及克隆

中国人兽共患病杂志 1999年第3期第15卷 论　　著

作者：冯新港　余新炳　李　焱　刘彦文

单位：中山医科大学寄生虫教研室（广州，510089）

　　关键词： 日本血吸虫；脂肪酸结合蛋白；RT-PCR；基因克隆

　　摘　要　目的　体外扩增日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白(SjFABPc)抗原的编码区基因序列，将其克隆到真核表达质粒pcDNA3中，为进一步对其进行核酸疫苗研究奠定基础。方法　特定寡核苷酸引物的设计与合成；异硫氰酸胍—酚—氯仿一步法分离日本血吸虫成虫RNA，RT-PCR扩增目的基因；分子克隆常规操作将扩增产物亚克隆至中间载体pUC18中，然后定向克隆到真核表达载体pcDNA3中。结果　RT-PCR特异性扩增出SjFABPc编码区基因序列，其片段大小为440bp；经酶切、PCR鉴定表明所构建的质粒pUC-SjFABPc和pCD-SjFABPc中含有所扩增的基因序列。结论　RT-PCR扩增的SjFABPc抗原编码区基因序列与预期长度相符合；成功地构建了含目的基因的真核表达质粒pCD-SjFABPc。从而，为进一步对其进行DNA免疫系列研究工作奠定了基础。

AMPLIFICATION AND CLONING OF THE GENE CODING FOR

　　CYTOPLASMIC FATTY ACID-BINDING PROTEIN FROM CHINESE

　　SCHISTOSOMA JAPONICUM SJFABPc

Feng Xingang　Yu Xinbing　Li Yan　Liu Yanwen

　　(Depertment of Parasitology,Sun Yat-Sen,University of Medical Sciences,Guangzhou,510089)

　　ABSTRACT　Aim In order to provide the basis for further study on DNA vaccine against Schistosoma japonicum,amplifying the gene coding for SjFABPc in vitro and cloning the fragment into the eukaryotic expression vector pcDNA3.Methods The design and synthesis of specific oligonucleotide primers;Total RNA was isolated from adult worms of Chinese S.japonicum using single-step method by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform(AGPC) extraction,coding region gene of SjFABPc was amplified by RT-PCR technique;the fragment from RT-PCR was firstly subcloned into cloning vector pUC18 via SacI and BamHI restriction sites and the cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3 via EcoRI and XbaI sites by routine molecular cloning approaches;the resulting construct was determined by PCR and restriction analysis methods.Results The coding region of SjFABPc gene was specifically amplified by RT-PCR,the size of amplified fragment was 440 base pairs;the cloning plasmid construct(pUC-SjFABPc) and expression plasmid(pCD-SjFABPc) contained the amplified fragment.Conclusion The results demonstrated that the amplified fragment was identical with the predicted one,the eukaryotic expression plasmid successfully constructed and provided the basis for further study on DNA immunization.

　　KEY WORDS　Schistosoma japonicum Fatty acid binding protein RT-PCR Gene cloning

　　血吸虫病是一种重要的人畜共患寄生虫病。目前，血吸虫病防制主要采取以化疗为主控制患病的策略^〔1〕。但由于化疗药物（吡喹酮）不能阻止重复感染、且存在副反应及可能引起药物抗性等，故期望抗血吸虫疫苗的研究将为防制提供有效措施。

　　由于血吸虫不能合成长链脂肪酸和胆固醇，必须从宿主体内摄取这些成分。因此，血吸虫脂肪酸结合蛋白(FABP)作为一种候选疫苗与药物作用的靶分子受到研究者们的重视。1994年WHO重点推荐6种曼氏血吸虫(S.mansoni)候选疫苗基因，Sm-14FABP是其中较为理想的一种^〔2〕。Tendler,M等^〔3〕报道用rSm14免疫家兔和小鼠分别诱导了高达56.7%～72.1%和50.6%～65.7%的减虫率。日本血吸虫(S.japonicum)相应抗原基因已被克隆^〔4〕、其基因工程重组蛋白具有良好抗原性的试验亦见报道^〔5〕。

　　核酸疫苗较之传统的疫苗（死疫苗或减毒活疫苗及蛋白抗原或基因工程重组疫苗）具有免疫稳定、制备操作简单、能诱发机体产生包括特异性CTL以及Th-细胞和体液应答在内的较为全面的免疫应答反应等优点^〔6〕，故其在抗传染病和寄生虫病的疫苗研制中日益受到重视。鉴于核酸疫苗方法的独特优点及日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(SjFABPc)抗原潜在的应用价值，本研究根据已发表的日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白抗原基因序列，自行设计一对特定的寡核苷酸引物，用RT-PCR扩增出SjFABPc编码区基因序列，并将其克隆到真核表达质粒载体pcDNA3中，为进一步对其进行核酸疫苗的研究奠定基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　日本血吸虫(S.japonicum)成虫　含尾蚴的阳性钉螺(O.hupensis)购自江苏省血吸虫病研究所。常规法尾蚴感染家兔40d后，经肝门静脉灌注收集成虫。

　　1.1.2　大肠杆菌(E.coli)DH5α、质粒pUC18、pcDNA3真核表达质粒等由本室保存。

　　1.1.3　主要酶类及其他试剂　异硫氰酸胍、Sarkosyl、β-巯基乙醇、T₄DNA连接酶、KlenowI酶、AMV逆转录酶等为Promega产品；各种限制性内切酶为华美公司产品；PCR系列试剂购自加拿大真达公司；其它试剂为国产分析纯。

　　1.1.4　PCR　依据已发表的日本血吸虫大陆株SjFABPc DNA序列^〔4〕，并结合PCGENE软件分析设计引物。引物P1：5′-CGCTCGAGATGTCTTCT-TTCTTGG-3′；引物P2：5′-TGAGATCTTGA-CCAGTCTATCAGT-3′。为使PCR产物既便于克隆至多种载体又符合引物设计的原则要求，在引物P1和P2的两端分别设计了XhoⅠ和BglⅡ，在酶切位点前加了2个保护碱基，由上海生工生物工程公司合成。

　　1.2　方法

　　1.2.1　成虫总RNA的提取　参照文献^〔7〕略作改进。取新鲜成虫50mg于冰浴匀浆器加500μl变性缓冲液(4M/L异硫氰酸胍、25mM/L NaCl、0.5% Sarkosyl、0.1M/Lβ-巯基乙醇）缓慢匀浆，匀浆液移至1ml Eppendorf管中，加1/10体积2M/L NaAc(pH4.0)、等体积水饱和酚及2/10体积氯仿：异戊醇(49∶1)充分摇匀，冰浴中静置15min，4℃离心20min(12 000r/mim)，取上清加等体积异丙醇，-20℃置1.5h，4℃离心20min(12 000r/min)弃上清，沉淀用50μl变性液与50μl异丙醇重悬置-20℃1h,4℃离心20min(12 000r/min)弃上清，沉淀用75%乙醇洗2次，干燥后加50μl DEPC处理过的灭菌水中。

　　1.2.2　RT-PCR　于0.5ml Eppendorf管中加10μl总RNA，5μl逆转录10×Buffer,1u(50pmol)反向引物P2，0.25μl RNA酶抑制蛋白，65℃保温10min后加5μl dNTP(2.5mM)、2μl AMV逆转录酶(9U/μl)、2μl ddH₂O,42℃保温2h，进行cDNA第一链的合成，80℃10min终止反应。以此cDNA为模板进行PCR，反应总体积为50μl,先进行5个循环：94℃1min+37℃1min+72℃1min30s；后进行30个循环；94℃1min+58℃1min+72℃1min，循环结束后72℃延伸5min终止。

　　1.2.3　RT-PCR产物的亚克隆　参照文献^〔8〕介绍的方法略加改进。PCR产物经XhoⅠ和BglⅡ酶切、质粒pUC18分别用SacI和BamHI酶切，从琼脂糖凝胶中DEAE插片法回收所需片段，目的基因与质粒经T₄DNA连接酶作用先行同粘端（由BglⅡ、BamHI酶切产生）连接，后KlenowI补平或删切另一对不同的粘端，再进行平端连接（见图1）。经CaCl₂介导转化试验、重组克隆子的初筛、PCR与酶切等步骤进行鉴定。

图1　质粒pUC-SjFABPc和pCD-SjFABPc的构建

　　Fig.1 Construction of cloning vector pUC-SjFABPc and expression plasmid pCD-SjFABPc

　　1.2.4　pCD-SjFABPc真核表达质粒的构建　参照文献^〔8〕方法，上述构建的亚克隆质粒经EcoRI、XbaI酶切，回收目的片段后定向克隆到pcDNA3的相应的多克隆酶切位点（见图1）。进行PCR与酶切鉴定。

　　2　结果

　　2.1　SjFABPc RT-PCR　以特异性的反向引物P2经逆转录酶作用，从日本血吸虫中国大陆株成虫总RNA提取物中合成SjFABPc基因cDNA第一链，以此为模板、用特异性的引物对P1P2经PCR方法扩增出一大小为440bp的DNA片段，与预期长度相符合（见图2）。

　　2.2　扩增产物的亚克隆与鉴定　RT-PCR产物被亚克隆到pUC18的多克隆位点而形成重组质粒pUC-SjFABPc。以此质粒DNA为模板进行PCR扩增，产生一大小与RT-PCR产物长度一致的片段（见图2）；质粒pUC-SjFABPc经EcoRI与XbaI双酶切后可回收到与PCR产物长度相一致的片段（见图3）。上述结果显示亚克隆质粒pUC-SjFABPc含有目的基因片段。

图2　PCR扩增SjFABPc基因的1％琼脂糖凝胶电泳

　　1.空白对照　2.pUC18 DNA模板　3.pUC-SjFABPc DNA模板　4.日本血吸虫逆转录cDNA模板　5.DNA标准分子量(PCR Markers)

　　Fig.2 The results of PCR amplification of SjFABPc gene in 1% ararose gel electrophoresis

　　1.Blank control 2.PCR products using pUC18 DNA as template 3.PCR products using pUC-SjFABPc DNA as template 4.RT-PCR products using cDNA from S.japonicum as template 5.PCR Markers

图3　pUC-SjFABPc的酶切分析与PCR鉴定

　　1.λDNA/EcoRI+HindⅢ Markers 2.pUC18 EcoRI、XbaI双酶切　3.pUC18 EcoRI单酶切　4.pUC-SjFABPc EcoRI单酶切　5.pUC-SjFABPc EcoRI、XbaI双酶切　6.质粒pUC-SjFABPc DNA模板的PCR扩增　7.DNA标准分子量(PCR Markers)

　　Fig.3 Identification of cloning vector pUC-SjFABPc by restriction analysis and PCR

　　1.λ DNA/EcoRI+HindⅢ Markers 2.pUC18 was digested with EcoRI and XbaI 3.pUC18 was digested with EcoRI 4.pUC-SjFABPc was digested with EcoRI 5.pUC-SjFABPc was digested with EcoRI and XbaI 6.PCR products using pUC-SjFABPc DNA as template 7.PCR Markers

　　2.3　pCD-SjFABPc真核表达质粒的构建与鉴定

　　上述pUC-SjFABPc经EcoRI与XbaI双酶切后回收的目的基因产物被克隆到pcDNA3的相应的多克隆酶切位点，形成真核表达质粒pCD-SjFABPc。所构建的质粒中，目的基因正向位于强启动子CMV的下游。质粒pCD-SjFABPc经EcoRI与XbaI双酶切及PCR鉴定，结果均产生一大小约为440左右的DNA片段，与预期长度相符合（见图4），说明表达质粒构建成功。

图4　pCD-SjFABPc的酶切分析与PCR鉴定

　　1.λDNA/EcoRI+HindⅢ Markers 2.pcDNA3 EcoRI、XbaI双酶切　3.pcDNA3 XbaI单酶切　4.pCD-SjFABPc EcoRI单酶切　5.pCD-SjFABPc EcoRI、XbaI双酶切　6.质粒pCD-SjFABPc DNA模板的PCR扩增　7.DNA标准分子量(PCR Markers)

　　Fig.4 Identification of cloning vector pCD-SjFABPc by restriction analysis and PCR

　　1.λDNA/EcoRI+HindⅢ Markers　2.pcDNA3 was digested with EcoRI and XhaI　3.pcDNA3 was digested with Xbal 4.pCD-SjFABPc was digested with EcoRI 5.pCD-SjFABPc was digested with EcoRI and XbaI 6.PCR products using pCD-SjFABPc DNA as template 7.PCR Markers

　　3　讨论

　　核酸疫苗较之传统的疫苗具有一些独特的优点^〔6〕，可能为血吸虫疫苗的研究开辟一条新途径。有关日本血吸虫核酸疫苗方面的研究近年亦见报道^〔9〕，但无SjFABPc候选抗原基因核酸疫苗方面的工作。本研究用分子克隆方法成功地构建了真核表达质粒pCD-SjFABPc，为进一步对其进行核酸疫苗的研究奠定了基础。

　　RT-PCR方法所获取的目的基因克隆到一定的载体上后可直接用于基因工程的表达；而用普通PCR方法直接从真核生物基因组DNA中扩增出的基因则往往是内含子和外显子相间排列的DNA分子，不能用于基因工程的直接表达。我们尝试以S.japonicum成虫基因组DNA为模板获取SjFABPc基因未获成功，扩增产物显示为与预期大小不相符合的多条非特异性的条带，反复摸索条件提高退火温度仍不能消除这种非特异性；而RT-PCR在同样的条件下则特异性地扩增出了SjFABPc抗原编码区基因序列。文献^〔5〕报道以日本血吸虫CDNA文库为模板进行PCR亦扩增出特异性的目的片段。我们推测日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因可能存在内含子。但在无法确证某一基因是否存在内含子的情况下，RT-PCR则是获取目的基因的重要途径。

　　为既便于将SjFABPc编码区基因片段定向克隆到多种载体（如痘苗病毒转移载体）中，又能满足引物设计的要求，我们在引物P1和P2的5′端分别引入了XhoI与BglⅡ酶切位点，RT-PCR产物可直接克隆到痘苗病毒转移载体中，但不能直接克隆至pcDNA3中。因此，我们采用了亚克隆的策略，所构建的亚克隆质粒pUC-SjFABPc既便于目的基因的保存、测序，又可方便地将目的基因切下正向克隆至真核表达质粒载体pcDNA3中。

　　目前，我们正在进行目的基因的测序、质粒pCD-SjFABPc经不同途径免疫小鼠的抗日本血吸虫保护作用等的研究工作。

　　4 参考文献

　　1.Report of a WHO Expert Committee.The control of schistosomiasis WHO Technical Report Series,No.728,WHO Geneva,1985.

　　2.Bergquist N R,Hall B F,et al.Schistosomiasis vaccine development.Immunologist,1994,2(4):131.

　　3.Tendler M,Vilar M M et al.Vaccination against Schistosomiasis and Fascioliasis with the new recombinant antigen Sm14:Potential basis of a multi-valent anti-helminth vaccine?Mem Inst Oswaldo Cruz Rio de Janeiro,1995,90(2):255.

　　4.Becker M M,Kalinna B H,et al.Gene cloning,overproduction and purification of a functionally active cytoplasmic fatty-acid-binding protein(Sj-FABP) from the human blood fluke Schistosoma japonicum.Gene,1994,148:321.

　　5.蔡学忠，田锷,等.日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达.生物化学与生物物理学报,1998,30(2):203.

　　6.Waine G J,et al.Nucleic acids:vaccines of the further Parasitol.today,1995,10(3):113.

　　7.Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction Anal.Biochem,1987,162(1):156.

　　8.Sambrook J,Fritsch E F,et al.Molecular cloning:A Laboratory Manual,2nd ed New York:Cold Spring Harbor.Lab Press,1989,263.

　　9.Yang W,Waine G J,et al.Antibodies to Schistosoma japonicum(asian bloodfluke)paramyosin induced by nucleic acid vaccination.Biochem Biophys Res Communi,212:1029.

收稿日期：1998年7月3日　修回日期：1998年11月23日