抗慢性淋巴细胞白血病独特型单抗SM6可变区基因序列分析

中华血液学杂志 1998年第7期第19卷 论　　著

作者：苏娜　杨敬　王晓林　沈关心

单位：430030　武汉，同济医科大学基础医学院免疫学教研室

　　关键词： 白血病；抗体，抗独特型；序列分析；基因克隆

　　摘要　目的:对独特型抗体可变区基因进行序列分析,为其基因工程抗体的构建打下基础。方法:采用TRIzolR试剂从分泌抗独特型抗体SM6杂交瘤细胞株中提取mRNA,以特异性引物采用PCR技术扩增并克隆出独特型单抗SM6重、轻链可变区(VH、VL)基因。将VH和VL基因分别克隆到pGEM-T载体中。采用链末端终止法荧光染色测定VH和VL基因序列,应用DNASIS7分析软件并与美国国立卫生研究院基因库比较分析。结果:5个克隆的重链基因序列一致,3个克隆的轻链基因中有2个克隆基因一致。结论:VH和VL基因分别属Q52、JH3和VK19、JK2。

　　DNA sequencing of variable regions of anti-idiotypic monoclonal antibody SM6 to B-CLL　Su Na, Yang Jing, Wang Xiaolin, et al. Department of Immunology, Tongji Medical University, Wuhan　430030

　　Abstract　Objective:To analyze the variable region sequences of an anti-idiotypic monoclonal antibody to human chronic B cell leukemia (B-CLL). Methods:The variable region sequences of light and heavy chains (VL、VH) of anti-idiotypic McAb SM6 to B-CLL were analyzed by their cDNA cloning and sequencing. Total RNA was extracted from a hybridoma cell line producing SM6. The VH and VL genes were amplified by RT-PCR with specific primers. The PCR products were cloned into pGEM-T vectors, then transfected into JM109. Results and Conclusion: It was confirmed by DNASIS7 sequence analysis that the full-length and potentially functional genes were successfully cloned. The VH gene expressed in SM6 belongs to Q52, the JH region using the JH3. The VL gene belongs to VK19, the JK region using JK2.

　　Key words　Leukemia　　Antibody, anti-idiotype　　Sequence analysis　　Gene cloning

　　国内外研究证明,抗独特型抗体具有模拟抗原及免疫调节双重作用,同时能克服机体免疫抑制或打破免疫耐受状态,可直接或间接促进机体特异性抗肿瘤免疫。B细胞淋巴瘤细胞表面表达免疫球蛋白(Ig)特异性独特型决定簇,抗独特型抗体可特异性与恶性细胞结合,通过CDC或ADCC效应杀伤恶性细胞。抗独特型抗体可作为治疗剂治疗淋巴瘤。但由于目前所用单克隆抗体(单抗)大多来自鼠源性,对人体是一种异种蛋白,长期应用使人产生抗鼠抗体,以致影响其疗效。因此改造鼠源性单抗可能会取得更好的效果。独特型单抗重、轻链可变区(VH、VL)DNA序列研究为抗原结合位点的分析和独特型表达以及新型的独特型基因工程抗体的构建奠定了基础。我们在应用细胞融合技术获得抗慢性淋巴细胞白血病(慢淋)独特型抗体的基础上,从SM6杂交瘤细胞株提取mRNA,以特异性引物采用聚合酶链反应(PCR)扩增并克隆出独特型单抗SM6重、轻链可变区基因。并对其基因序列进行了测定和分析。

材料和方法

　　1　抗慢淋独特型单抗杂交瘤细胞株SM6为本室制备。pGEM-T载体系统购自Promega公司。大肠杆菌XL2-Blue为一种高效的支持琥珀突变载体生长的重组缺陷宿主菌,购自Stratagen公司。

　　2　试剂　TRIzolR试剂及cDNA合成试剂均为Gibco公司产品，PCR系列试剂购自Boehringer Mannheim公司，质粒提取试剂为Qiagen Dusseldorf产品，DNA序列测定所用荧光染色末端循环测序试剂盒为Perkin Elmer公司产品。

　　3　引物

　　3.1　PCR扩增引物:5′端引物与小鼠免疫球蛋白前导序列互补,3′端与FR4序列互补。

　　VL B:5′-GGGGTCGACCTCACCATGGATTTTCAAGTGCA-GATTTTCAG-3′;

　　VL F:5′-GCGGAATTCAGCCCGTTTGATTTCCAACTT-3′;

　　VH B:5′-GGGGTCGACCTCACCATGGCTGCTTTGGGGCT-GCTCTTCT-3′;

　　VH F:5′-GTCGCGGCCGCTGATCACTAACCTGCGAATG-GAGGTGT-3′。

　　B：上游引物；F：下游引物。

　　3.2　菌落或质粒PCR引物：

　　Dyfor:5′-AAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCG-3′;

　　Dyrev:5′-GCTTCCGGCTCGTATATTGTGTG-3′。

　　3.3　测序引物：

　　M₁₃通用引物:5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′;

　　M₁₃(-40):5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′;

　　SP6:5′-AATTAGGTGACACTATAGAATAG-3′;

　　T7:5′-AATTAACCCTCAGTAAAGGGAAG-3′。

　　4　杂交瘤总RNA的提取和逆转录合成cDNA第一条链　采用TRIzoL试剂盒，按说明书操作提取RNA,并采用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA第一条链。

　　5　cDNA的PCR扩增与VH和VL DNA的克隆　cDNA 2μl,10×PCR 缓冲液5μl,10mmol/L dNTP 5μl,25mmol/L MgCl₂3μl,VH或VL引物各1μl(10μmol/L),Taq DNA聚合酶1μl(2U),加双蒸水至50μl。将上述各管分别加入适量石蜡油,置PCR扩增仪上96℃预变性5分钟。94℃1分钟，42℃30～45秒,72℃1分钟,30个循环,最后1个循环72℃延伸10分钟。取PCR反应产物5～10μl,用2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色分析,紫外灯下作凝胶摄影。pGEM-T载体与PCR产物(VH或VL)连接,取2μl连接产物转化JM109高效受体菌。转化菌经过IPTG/X-gal蓝白菌落初步筛选,取各培养皿中白色菌落,进行菌落PCR或质粒PCR筛选鉴定阳性克隆。

　　6　克隆的可变区序列测定　以阳性菌落PCR产物或质粒PCR产物为模板,将测序引物2μl(4pmol)和测序反应试剂混合物8μl(包括4种不同荧光素标记ddNTP,测序酶及其缓冲溶液等)混合,然后与10μl ExoⅠ消化的PCR产物混合,并进行PCR扩增。扩增条件:96℃预变性2分钟后,96℃ 10秒,50℃ 5秒,60℃ 4分钟,25个循环,最后60℃延伸6分钟。扩增产物进行纯化,选择使用Perkin Elmer公司的荧光染色末端循环测序试剂盒和自动测序分析仪进行测序。

　　7　序列资料的分析　核苷酸序列的同源性分析比较和氨基酸序列的推导分析,采用DNASIS7程序进行。部分核苷酸序列与美国国立卫生研究院(NIH)基因库进行比较。

结　　果

　　1　SM6 VH和VL基因的扩增　参照文献［1］设计引物,经PCR扩增VH基因约400bp，VL约370bp,结果见图1。

1：重链可变区基因；2：轻链可变区基因；M：Marker

　　图1　SM6单抗可变区基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳

　　2　SM6可变区基因的克隆　将PCR扩增产物分别与pGEM载体连接,重组质粒载体VH-pGEM-T和VL-pGEM-T转化JM109宿主菌。经选择培养筛选鉴定,琼脂糖凝胶电泳可见约600bp条带,包括与载体克隆位点互补序列约200bp,即为阳性克隆。

　　3　SM6可变区基因序列分析　阳性克隆DNA序列测定结果表明:5个克隆的重链基因序列一致,3个克隆的轻链基因中有2 个克隆完全一致,另一克隆缺失CDR3和FR1部分基因。重链序列与基因库中的独特型抗体基因序列进行随机比较有较高的同源性(98％),取其中重链和轻链各2株用核酸分析软件(DNASIS7)进行分析,并用Kabat等编号的Ig编码序列图谱分析,重链共测出360bp(图2),轻链共测出327pb(图3),编码120和109个氨基酸序列,分别是VH和VL。可变区序列包括FR1,2,3,4及CDR1,2,3区(图2,3的方框中)。

图2　抗独特型单抗SM VH核苷酸及氨基酸序列

图3　抗独特型单抗SM VL核苷酸及氨基酸序列

讨　　论

　　独特型决定簇位于Ig分子的可变区中,该区域氨基酸序列具有高度可变性,血清学分析证明,针对独特型决定簇的抗体仅与免疫同源性Ig分子反应。根据Jerne的网络学说,Ig的可变区可作为抗原诱导抗独特型抗体的产生。深入研究独特型-抗独特型反应及其基因的调控,将有可能更好地了解因免疫网络缺陷而造成各种疾病的发病机制。

　　国外学者证明,B细胞或T细胞的单个克隆能够发生癌变,形成淋巴瘤,患者所有的癌细胞都在其表面表达独特型决定簇。应用抗独特型抗体可对相应疾病进行分析诊断及治疗。在过去的工作中,我们证明独特型单抗仅与同源患者血清IgM呈阳性反应,而对正常人血清及一系列骨髓瘤蛋白无作用。提示B细胞慢淋患者血清Ig可变区独特型决定簇有别于正常人Ig独特型特征。进一步用此抗独特型单抗对体外培养的各类白血病细胞系表面独特型进行分析,结果表明抗独特型单抗与B细胞系白血病细胞反应阳性率最高,表明该单抗可识别B细胞瘤表面独特型决定簇,抗独特型单抗可作为特异性探针对B细胞系恶性肿瘤进行诊断和分型^［2,3］。但鼠源性抗体用于体内还存在诸多问题尚未解决。为此亦可通过基因工程技术改造鼠源性单抗,以减少患者对单抗的免疫反应。

　　我们在系统地研究抗独特型单抗SM6的生物学和血清学特性基础上，为了构建抗独特型基因工程抗体,对独特型抗体的可变区基因进行了扩增、克隆、测序。利用DNASIS7和基因库软件分析了抗独特型单抗SM6可变区DNA序列,VH与Kaartinen等^［4］报道的序列进行同源性比较,其同源性为96％,VL与Sikder等^［5］报道的序列比较,其同源性为97％。通常大多数的VH基因家族属J558,本单抗属Q52,其重链CDR与其它单抗相比具有明显的异质性。由此可见,独特型决定簇位于Ig分子的可变区,特别是可变区中超变区CDR区。SM6单抗VH利用Dsp2.2 D区及JH3基因,VL利用VK19及JK2基因。

　　本课题受国家教委回国人员基金资助

参 考 文 献

　　1　Kabat EA，Wu TT, Reid-Miller M,et al. Sequences of proteins of immunological interest. Bethesda: NIH,USA,1991. 103-533.

　　2　沈关心,苏娜,孙蓓,等.慢性淋巴细胞白血病独特型单克隆抗体的研究. 中华微生物和免疫学杂志,1990,10:371-375.

　　3　Wang XL,Cao XF,Su N, et al. Experimental study on antitumor effect of monoclonal anti-idiotypic antibody-DNR conjugate to leukemia. Chin J Cancer Res, 1995,7:20-23.

　　4　Kaartinen SMH, Solin M, Makela O, et al. Allelic forms of immunoglobubin V genes in different strains of mice.EMBO,1989,8:1743.

　　5　Sikder SK, Akolkar PN,Kaladas PM, et al. VL sequences of variable regions of hybridoma antibodies to alpha-(1-6) dextran in BALB/c and C57BL/6 mice.J Immunol， 1985,135:4215-4221.

(收稿：1997-08-11　　修回：1998-03-02)

(校对：徐丽娟)