间隙连接蛋白Cx32在肝细胞肝癌、肝硬变及病毒性肝炎中的表达
癌症1999年第18卷第1期
马向东 隋延仿 王文亮
摘 要 目的：探讨细胞间隙连接蛋白Cx32在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)及其癌旁肝、肝硬变(liver cirrhosis, LC)、病毒性肝炎(viral hepatitis, VH)和正常肝组织中的表达和意义。方法：应用SP免疫组织化学法检测Cx32在47例HCC及其15例癌旁肝、19例LC、8例VH及和9例正常肝组织中的表达。结果：Cx32蛋白表达既定位于肝细胞胞浆中，又定位于胞膜上，也可二者同时阳性。Cx32在HCC及癌旁肝、LC、VH和正常肝组织中阳性率分别为42.6％、73.3％、73.7％、75.0％和88.9％。χ2检验，Cx32在HCC中的表达明显低于在癌旁肝、LC、VH及正常肝组织的水平(P＜0.01)。随着HCC分化程度的降低，其阳性率有所下降。结论：Cx32表达减弱可能是HCC发生的重要环节。
关键词：间隙连接 肝肿瘤 肝硬变 病毒性肝炎 免疫细胞化学
间隙连接(gap junction)是普遍存在于动物组织中的一种细胞连接形式，通过Cx介导的细胞间连接通讯(gap junction intercellular communication, GJIC)，对细胞的增殖、分化进行调控[1]。间隙连接由相邻细胞膜上的连接子(connexon)相互衔接而成，连接子的蛋白质亚单位即间隙连接蛋白(connexin, Cx)[2]。间隙连接功能缺陷与多种肿瘤的恶性增殖有关，可能是肿瘤发生的重要环节[1]。Cx多基因家族中Cx32在肝脏中特异性表达[3]，研究Cx32在HCC、LC、VH和正常肝中的表达，进一步探讨与肝细胞性肝癌发生的关系，国内尚未见报道。
1 材料与方法
1.1 标本
47例HCC、15例癌旁肝组织、19例LC、8例VH和9例正常肝组织，均为本校西京医院1994年～1997年外科手术切除标本，经病理证实，根据WHO分类标准分为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ级。标本均经10％福尔马林固定，石蜡包埋，4μm厚切片。
1.2 试剂
抗Cx32McAb、SP免疫组化试剂盒及DAB染色试剂盒均为美国Zymed公司产品。
1.3 免疫组化染色
切片脱蜡至水，3％H2O2灭活30min，正常山羊血清封闭30min，倾去血清，加Cx32McAb(1∶1000)37℃孵育1h，PBS振洗后滴加生物素化二抗(1∶100)37℃，30min，PBS振洗，加辣根酶标记的链霉卵白素(1∶100)37℃，10min，PBS振洗，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封片。
1.4 结果判定
阴性(－)：阳性细胞＜5%；阳性(+)：5%～50%细胞阳性染色；强阳性(++)：阳性细胞＞50％。选择Cx32高表达的正常肝组织为阳性对照，以PBS代替一抗作为空白对照。所有结果均经χ2检验。
2 结果
2.1 Cx32的分布
Cx32在HCC、LC、VH及正常肝组织中均有不同程度的表达。HCC阳性细胞以胞浆内弥漫、均匀分布为主(图1)，也可见胞膜阳性(图2)，染色较淡。癌旁肝细胞阳性较HCC明显(图3)。LC有胞浆、胞膜阳性(图4)，VH以胞膜为主，染色均较深(图5)，正常肝组织胞浆阳性为多见，明显深染(图6)。
图1 肝细胞肝癌组织，Cx32抗原定位于胞浆。SP法，×400；图2 肝细胞肝癌组织，Cx32抗原定位于胞膜。SP法，×400；图3 癌旁肝阳性细胞，Cx32抗原胞浆阳性。SP法，×400；图4 肝硬变组织，Cx32抗原定位于胞浆。SP法，×200；图5 肝炎组织，Cx32抗原定位于胞膜。SP法，×400；图6 正常肝组织，Cx32抗原呈胞浆阳性。SP法，×400
2.2 Cx32在HCC、LC、VH及正常肝中的表达
χ2检验表明，Cx32在HCC中阳性率较其在LC，VH正常肝组织中的阳性率有显著(P＜0.01)，结果表1。
表1 CX32蛋白在HCC、LC、VH及正常中阳性率
| 病理类型 |
例数 |
阳性例数 |
% |
| - |
+ |
++ |
| HCC |
47 |
27 |
13 |
7 |
42.6 |
| LC |
19 |
5 |
6 |
8 |
73.7* |
| VH |
8 |
2 |
2 |
4 |
75.0* |
| 正常肝 |
9 |
1 |
1 |
7 |
88.9* |
*与HCC比较，P＜0.01
2.3 Cx32在HCC及其癌旁肝、正常肝中表达
经χ2检验，Cx32在HCC中阳性率明显低于其在癌旁肝及正常组织的阳性率(P＜0.01)，随着HCC分化程度降低，其阳性率有所下降，结果见表2。
表2 Cx32蛋白在HCC及其癌旁肝、正常肝中阳性率
| 病理类型例数 |
例数 |
阳性例数 |
% |
| - |
+ |
++ |
| HCC Ⅰ |
8 |
4 |
3 |
1 |
50.0 |
| HCC Ⅱ |
21 |
12 |
7 |
2 |
42.9 |
| HCC Ⅲ |
18 |
11 |
3 |
4 |
38.9 |
| HCC癌旁肝 |
15 |
4 |
6 |
5 |
73.3* |
| 正常肝组织 |
9 |
1 |
1 |
7 |
88.9* |
*与HCC比较，P＜0.01
3 讨论
现已克降出Cx多基因家族的13个成员，在结构上有明显的种系间保守性和表达的组织特异性，且有一定叉现象[1]。其Cx32在肝细胞中有特异性表达[4]。应用Cx32McAb，研究国人HCC、LC、VH及正常肝组织中Cx蛋白的表达，国内尚未见报道。
本研究表明，Cx32在肝细胞及HC细胞中均存在不同程度的表达，既定位于胞浆内，又有胞膜阳性，或二者同时阳性，与国外文献报道相符合[4]。
目前国外对Cx32在HCC中的研究，多集中在其表达的阳性率上[6]，Cx32在HCC、LC及正常肝中阳性率分别为56.2％、73.1％和84.9％，与本研究结果相似。对于深入探讨Cx32这一与细胞分化、进展阶段的表达规律的研究，尚未见系统报道。
本研究发现，Cx32在正常肝细胞中有较高水平的表达(88.9％)，阳性细胞深染。在VH、LC中表达比正常肝组织低(75.0％、73.7％)，VH因胞浆疏松比正常肝组织低(75.0％、73.7％)，VH因胞浆疏松化和汽球样变使阳性染色集中在胞膜上。Cx32在HCC中表达更明显降低(42.6％)，且染色强度明显弱。Cx32的表达减弱与正常肝、VH、LC至HCC的恶性进程密切相关[7]。
实验还对Cx32在HCC及其癌旁肝中的表达进行了分析，发现Cx32在二者中的表达阳性率明显不同。癌旁肝细胞虽然有? 蛊刃晕跸窒螅粜匀旧越仙睿粜月蚀?3.3％，共周围的HCC细胞淡染甚至无阳性染色，形成明显对比，显示癌旁肝细胞与肝癌细胞间生物性质不同。进一步证实Cx32表达异常与HCC的形成及其恶性特征有关。
不同分化阶段的HCC组织中，Cx32的表达也存在差别，在HCCⅠ级、Ⅱ级、Ⅲ级中的阳性率分别为50.0％、42.9％和38.9％，提示分化程度降低，Cx32的表达水平逐渐下降。
现有资料已明确，间隙连接通讯功能的缺陷以间隙连接基因表达的异常为基础，与肿瘤的恶性增殖和转化密切相关[7]。有认为Cx基因的稳定表达可能有抑瘤用，可能具有重要抑癌因基[1]。本研究提示，Cx32表达下降可能是HCC的发生的重要环节[8]，其详尽的分子机制尚需深入研究。
作者单位：第四军医大学病理学教研室(西安，710032)
参考文献
1 Kumar NM, Gilula NB. The gap junction communication channel〔J〕. Cell, 1996, 84:381.
2 Stauffer KA, Kumar NM, Gilula NB, et al. Isolation and Purification of gap junction channels〔J〕. J Cell Biol, 1991, 116(1):141.
3 Yoshizawa T, Watanabe D, Hirose M,e t al. Dimethylsulfoxide maintains intercellular commumication by preserving the gap junctional protein connexin 32 in primary cultured hepatocyte doublest from rats〔J〕. J Gastro ＆ Hepatol, 1997, 12:325.
4 Krutovskikh V, Mazzoleni G, Mironov N, et al. Altered homologous and heterologous gap-junctional intercellular communication in primary human liver tumors associated with aberrant protern localization but not gene mutation of connexin 32〔J〕. Int J Cancer, 1994, 56:87.
5 Tsuda H, Asamoto M, Baba H, et al. Cell proliferation and advancement of hepatocarcinogenesis in the rat are associated with decrease in connexin 32 expression〔J〕. Carcinogenesis, 1995, 15910:101.
6 Yamaoka Y, Nouchi T, Tazawa J, et al. Expression of gap junction protein connexin 32 and E-cadherin in human hepatocellular carcinoma〔J〕. J Hepatol, 1995, 22(5):536.
7 Holder JW, Elmope E, Barrett JC. Gap junction function and cener〔J〕. Cancer Res, 1993, 53:3475.
8 Neveu MJ, Hully JR, Babcock KL, et al. Multiple mechanisms are responsible for altered expression of gap junction genes during oncogenesis in rat liver〔J〕. J Cell Sci, 1994, 107(pt1):83.
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