大肠癌微卫星不稳定性及其临床意义

中华肿瘤杂志 1999年第3期第21卷 临床研究

作者：熊斌　郑树　蔡心涵

单位：熊斌（现在武汉市湖北医科大学附属第二医院，430071）、郑树、蔡心涵　310009 杭州，浙江医科大学肿瘤研究所

　　关键词： 结直肠肿瘤；微卫星DNA；微卫星不稳定性

　　【摘要】　目的　了解大肠癌微卫星不稳定性（microsatellite instability, MI）情况。方法　用6个微卫星位点检测PCR扩增所选位点PCR产物用8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染。结果　60例大肠癌中，20例表现MI，其中11例为复制错误（replication errors, RER）阳性。RER阳性与RER阴性大肠癌患者相比，发病年龄较年轻，一级亲属有恶性肿瘤病史者明显高于RER阴性，倾向位于结肠，呈浸润性生长，Ⅲ～Ⅳ期比例高。5例大肠癌伴大肠腺瘤病例中，4例腺瘤有MI。结论　中国人大肠癌MI发生率介于文献报道之间，MI为大肠癌形成过程中的早期分子事件，RER为肿瘤易感指标之一。

Study of microsatellite instability of colotectal cancer and its clinical significance

　XIONG Bin, ZHENG Shu, CAI Xinhan.

　　【Abstract】　Objective　To evaluate microsatellite instability (MI) of colorectal cancerin China.Method Replication error (RER) status was examined by using 6 microsatellite loci D2S123, D2S119, D13S160, D8S282, D3S1293 and D18S58. The loci were amplified by PCR technique. The PCR products were separated on denatured polyacrylamide gel and then silver stained.Results　Of the 60 cases of colorectal cancer studied, 20 (33.3%) showed MI, 11 cases (18.3%) were RER positive. In 11 RER-positive cases, 4(36.4%) had family history of malignant tumor, while only 8.2% had positive family history in RER-negative cases (P＜0.05). The RER-positive patients were younger, and their cancer occurred more frequently in the colon with invasive type of growth. There were more cancers in Dukes III and IV in the RER-positive patients. In 5 colorectal cancer cases associated with adenoma, MI was detectable in 4 adenomas.Conclusion　MI phenotype might be present ubiquitously in sporadic colorectal cancers in China. Its frequency is comparable to that of other reports. MI is a relatively early molecular event in the genesis of colorectal cancers. RER is a useful sign of susceptibility to the development of colorectal cancer.

　　【Subject words】　Colorectal neoplasms　　Microsatellite DNA　　Microsatellite instability

　　微卫星DNA 是大量随机分布于真核生物整个基因组中的1～6个简单重复核苷酸序列，微卫星不稳定性(microsatellite instability, MI)是指由于复制错误(replication errors, RER)引起的简单重复序列的增加或丢失，其在恶性肿瘤发生发展过程中的作用已受重视，被认为是大肠癌的一种发病机制。我们对60例大肠癌组织的MI进行了研究，并结合临床病理资料，探讨其临床意义。

　　材料与方法

　　1.标本收集和基因组DNA提取：自浙江医科大学第二附属医院肿瘤科1996年3月～1997年5月间经病理证实的大肠癌患者60例，男37例，女23例。年龄32～78岁，平均年龄(56±12)岁。按Dukes分期标准，Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期27例。现场取手术切除组织标本，立即置入液氮中保存，直至提取基因组DNA。每份标本包括肿瘤组织和相应的正常肠粘膜，基因组DNA提取采用蛋白酶k消化，酚氯仿抽提法。

　　2.MI检测：选用了D2S119、D13S160、D8S282、D3S1293、D2S123和D18S58等6个微卫星位点进行检测，PCR反应体系为50 mmol/L KCl,10 mmol/L Tris-Cl, 0.1%Trito X-100, 1.5 mmol/L MgCl₂,200 μmol/L dNTPS,模板DNA200 ng，上下游引物各50 pmol，Taq酶1U，加去离子水至50 μl。PCR反应参数为：94℃变性5分钟，然后进入循环(94℃ 45秒，退火温度30秒，72℃ 1分钟)，共35个循环，最后70℃延伸10分钟，4℃保存。PCR产物用8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后进行银染。

　　3.判断标准：分析电泳图谱，MI表现为肿瘤组织相对于正常组织出现额外的条带、等位带产生迁移率的改变或等位带浓度增加。在检测的6个微卫星位点中，如果有两个或两个以上位点表现MI，则定义为RER阳性^［1,2］。

　　4.统计处理：采用t检验、χ²检验和Fishers确切概率法，检验水准（α）定为0.05，统计在SPSS 6.0软件上完成。

　　结果

　　1.MI发生率：60例标本中,33.3%（20/60）表现MI，RER阳性11例，占18.3%。6个位点中，MI发生率依次为：D3S1293为18.3%(11/60)，D2S123为13.3%(8/60)，D8S282为13.3%（8/60），D18S58为11.7%（7/60），D2S119为11.7%（7/60），D13S160为6.7%（4/60）。本组收集到5例大肠癌伴大肠腺瘤病例标本，4例腺瘤检测到MI，其中2例腺瘤和腺癌均为RER阳性；2例仅腺瘤存在MI，而腺癌未检测到。

　　2.RER阳性大肠癌的临床特征：60例大肠癌中，发现RER阳性11例，年龄32～78岁，平均年龄(52±14)岁。RER阴性49例，年龄34～78岁，平均年龄(57±13)岁，RER阳性组比RER阴性组平均发病年龄小(P=0.18)。6例40岁以下的大肠癌中，RER阳性3例；54例40岁以上的病例中，RER阳性8例（P=0.069）。11例RER阳性大肠癌中，有4例一级亲属有恶性肿瘤病史，占36.4%；49例RER阴性病例中，也有4例一级亲属有恶性肿瘤病史，占8.2%； RER阳性病例有恶性肿瘤家族史的比例明显高于RER阴性（P=0.031)。

　　3.RER阳性大肠癌的病理特征：RER阳性组中，6例位于结肠，占54.5%，其中位于右半结肠5例。RER阴性组中，21例位于结肠，占42.9%，其中位于右半结肠12例，占24.5%。RER阳性病例中，隆起型1例，浸润型10例。RER阴性病例中，隆起型14例，占28.6%；浸润型35例，占71.4%。 RER阳性组中高中分化大肠癌8例，占72.7%；低分化3例，占27.3%。RER阴性组中高中分化38例，占77.6%；低分化11例，占22.4%。 RER阳性组中，Dukes分期为Ⅰ～Ⅱ期5例，占45.5%；Ⅲ～Ⅳ期6例，占54.5%。RER阴性组中，Ⅰ～Ⅱ期28例，占57.1%；Ⅲ～Ⅳ期21例，占42.9%。从以上可以看出，RER阳性大肠癌与RER阴性大肠癌比较，在肿瘤部位、生长方式、Dukes分期等方面有一些差别，但因病例数较少，未显示出其统计学意义。

　　讨论

　　1.大肠癌MI及其临床意义研究：MI是肿瘤常见的遗传改变之一。最初在大肠癌，特别是遗传性非息肉性大肠癌（HNPCC）中观察到，随后在胃癌、胰腺癌、小细胞肺癌、乳腺癌及某些癌前病变和良性肿瘤中检测到不同程度的MI，提示MI是肿瘤性疾病中一个普遍存在的现象。目前认为MI是错配修复（MMR）功能缺陷所致，已发现的5个MMR基因hMSH₂、hMSH₆、hMLH₁、hPMS₁和hPMS₂中的任何一个突变均可引起MI^［3］。

　　大肠癌的MI国外已做过较多研究，以RER作为分子标志，将大肠癌分为不同亚型，有望用来推测预后和指导治疗，具有一定的应用前景。本组60例大肠癌中，绝大部分为散发性病例。我们对RER阳性与RER阴性大肠癌的临床病理资料进行比较，发现RER阳性组发病平均年龄比RER阴性组小。不同年龄组比较，年龄组越小，RER阳性率越高，40岁以下组阳性率最高。由于例数较少，与40岁以上组相比，差异无显著性（P=0.069）。RER阳性大肠癌倾向位于结肠，呈浸润性生长，Dukes分期Ⅲ～Ⅳ期比例高。提示结肠肿瘤与直肠肿瘤、青年人大肠癌与老年人大肠癌在发病机制上可能存在差异，结肠肿瘤和青年人大肠癌倾向于遗传上的改变而引起一系列癌基因和(或)抑癌基因失活，最终引起细胞恶性转化，发生肿瘤，表明RER阳性者为一组特殊遗传易感人群。

　　2.MI与大肠癌发展的相关性：本组MI的检出率为33.3%，RER阳性率为18.3%，介于文献报道的12%～40%之间^{［2，4，5］}。MI检出率的差异可能与微卫星位点选择，以及不同种族、不同病例有关。不同微卫星位点MI的敏感性不同，这方面还有待进一步研究。本研究选用的6个位点中，以D3S1293和D2S123两个位点的MI发生率较高，分别为18.3%和13.3%。这两个位点分别位于hMLH₁和hMSH₂基因附近，提示该两个基因在MI大肠癌发生发展中起重要作用，很可能hMLH₁基因在MI大肠癌形成过程中的作用比hMSH₂更明显。如若可能选择检测染色体6个或10个相关位点，必可避免2个位点的局限性，将更具普遍意义。

　　已往的研究认为，在HNPCC中，RER为早期分子事件。但在散发性大肠癌形成过程中何时获得RER，文献报道不一。有文献报道认为，RER是大肠癌形成中的早期事件，发生在癌前病变或腺瘤向癌的转化过程中^［6-8］。但也有相反的报道，认为RER是大肠癌形成过程中的一个晚期事件，是在肿瘤的进展和转移过程中获得^［9，10］。我们检测了5例大肠癌伴大肠腺瘤的病例标本，有4例腺瘤检测到MI，其中2例腺瘤和腺癌均为RER阳性；另外2例仅腺瘤有MI，而腺癌未检测到。说明RER在腺瘤阶段即可发生，支持RER为大肠癌癌变过程中早期分子事件的观点。

　　参考文献

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收稿：1998-06-23　　修回：1998-07-20