大肠癌 p53 抑癌基因突变与临床病理特点的关系

肿瘤防治杂志 2000年第6期第17卷 基础研究

作者：马恒　王磊　孙现军　胡德蓉　刘岩松　李永清

单位：马恒　王磊　孙现军　胡德蓉　刘岩松　李永清（济南市250117　山东省肿瘤防治研究院）

关键词：大肠肿瘤；基因，p53；病理学，临床

　　【摘要】　目的：探讨 p53 基因突变与大肠癌临床病理特点的关系。方法：应用 PCR-SSCP 技术检测 135 例大肠癌患者 p53 基因第5、6、7、8外显子的突变。结果：153 例大肠癌患者 p53 基因的突变率为54.07%，p53 基因突变与大肠癌的病理分级、临床分期、淋巴结转移及年龄均有关。结论：p53 基因与大肠癌的发生、发展及转归均有明显的关系。检测 p53 基因突变既可作为大肠癌的诊断方法，也可作为大肠癌预后的判定指标。

　　中图分类号：R735.34　　　　文献标识码：A　　　　文章编号：1009-4571(2000)-0600-04

Relationship Between Mutation of Antioncogene p53 and Clinicopathology in Colcorectal Cancer

MA Heng,WANG Lei,SUN Xian-jun,et al.

　　(Shand ong Tumor Hospital,Jinan 250117)

　　【Abstract】　Objective:To study the reationship between mutation of p53 gene and clinicopathology in colorectal cancer.Methods:The mutations of exon 5,6,7 and 8 of p53 gene in 135 patient with colcorectal cancer were detected by PCR-SSCP.Results:The mutation rate of p53 gene was 54.07%,and the mutation of p53 gene was correlated with histologie grade,clinical stage,metastasis of lymph nodes and patients'age.Conclusions:p53 genemay play an important role in the onset,development and outcome of colorectal cancer,and detection of mutation of p53 might be a diagnotic method as well as a prognostic factor in colorectal cancer.

　　【Key Words】　colorectal cancer;p53 gene;clinicopathology

　　采用 PCR-SSCP 方法对大肠癌组织 p53 基因第5、6、7、8外显子突变进行检测，以探讨大肠癌 p53 基因突变及其与临床病理的关系。

　　1　材料与方法

　　1.1　一般资料

　　135 例大肠癌石蜡标本取自山东省肿瘤防治研究院1994年1月～1996年12月经手术切除(不包括局部切除)的大肠癌病例；年龄18～78岁，平均57.6岁。所有病例均经病理证实，并有完整的临床资料。标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋。另选择该院25 例正常大肠粘膜的石蜡标本作对照组。

　　原发肿瘤的大小、大体类型、浸润深度、淋巴结转移情况依据原始病理报告。肿瘤部位、远处转移情况依据原手术记录。组织学分型依据《中国常见恶性肿瘤诊治规范》第3分册《大肠癌》之标准进行。大肠癌组织学分级采用 Broder 分级法。大肠癌临床病理分期采用改良 Duke's 分期法。

　　1.2　引物选择

　　引物合成与纯化由北京赛百盛公司完成，OPC 纯化。p53第5、6、7、8外显子引物序列见表1。

表1　p53基因第5、6、7、8外显子引物序列

　　1.3　PCR 扩增体系

　　PrimerⅠ　1.0 μ mol/L　1.0 μ1，dNTPs　200 μ mol/L　4.0 μ1，10×Buffer　5.0 μ1　TaqE　1.5 U/L　0.3 μ1，Sample DNA　10.0 μ1，ddH₂O　补充至 50 μ1。

　　1.4　方法

　　1.4.1　标本脱蜡　石蜡包埋组织切成5～10 μm 厚的薄片，取2～3片放入已有编号的 eppendorf管中，加入20 μ1二甲苯，浸泡1 h。微微摇动，经3 000 r/min离心5 min，去上清，如此重复5～8遍。

　　1.4.2　梯度水化　依次用浓度为100%、90%、75%、50%、25%的乙醇梯度水化，SSC 液冲洗2遍，去上清。

　　1.4.3　消化　向各管中加入消化液 1 ml(1 ml SSC 中含1% SDS 和 100 μg 蛋白酶 K)，置55℃水浴 3h。

　　1.4.4　纯化　等体积饱合酚萃取1次，加入氯仿：异戊醇(24∶1)，颠倒混匀5 min，10 000 r/min 离心10 min，吸取上层水相加入另一已有相应编号的 eppendorf 管中，加入等体积的4℃的异丙醇，混匀后置 -20℃ 20 h，4℃条件下 14 000 r/min离心15 min，去上清，沉淀中加入 1 ml 已预冷至 4℃的75%的乙醇，4℃条件下，14 000 r/min离心15 min，去上清，37℃温箱中保温1 h。

　　1.4.5　DNA 含量检测　向烘干的离心管中加入50～100 μl的1×STE，混匀，置4℃中1 h，取5 μl 此溶液于一洁净的康氏管中，加入3ml超纯水混匀，分别在波长处调零点，检测各标本 DNA 的 OD₂₆₀和 OD₂₈₀值，并计算相应 DNA 含量。

　　1.4.6　PCR 扩增　上述扩增体系按常规加样顺序上机，进行94℃变性，55℃退火，72℃延伸，共35个循环。

　　1.4.7　PCR 产物的检测　取10 μl PCR 扩增产物与 1.0 μl 上样缓冲液，混匀后加入到1.5% 琼脂糖凝胶加样孔中，电压8～10V/cm,电泳，至溴酚兰离加样孔2 cm 时，在紫外透射观察仪中观察。

　　1.4.8　p53-SSCP 分析　取10 μl MTS-PCR 产物置于 0.5 ml 洁净 Eppendorf 管中，加入等体积的 PAGE 上样缓冲液，经98℃ 5 min热变性后，速冷于0℃的冰水中，然后上样于预冷至 4℃的 PAGE 凝胶中，以80 V条件下电泳，当二甲苯青移至胶长的3/4处停止电泳。取下凝胶，浸于10%冰乙酸中，在恒温摇床上固定30 min。倾去固定液，用超纯水冲洗3遍，每次摇动1～2 min，加入1% AgNO₃ 染色30 min，再用超纯水冲洗1遍，加入显色液，在摇床上显色至条带清晰而背景不太深时停止。与正常对照的单链DNA 带型的泳动距离对比，观察并记录结果。

　　2　结果

　　135 例大肠癌及25 例正常粘膜经 PCR扩增后，均成功获得 p53 基因第5、6、7、8外显子的全部片段。25 例正常粘膜经电泳后出现2条带，单链迁移率相同，未见异常突变带。135 例大肠癌有73 例 SSCP 显示有突变条带，阳性率为54.07%，与正常粘膜比较差异有显著性，P＜0.01 (表2)。

表2　135 例大肠癌 p53 基因突变情况

　　第5、6、7、8外显子的突变率分别为15.07%　(11/73)、20.54%(15/73)、36.99%(27/73)和27.74%(20/73)，它们之间差异无显著性， P＞0.05。

　　2.1　大肠癌中 p53 基因突变与病理分级的关系

　　135 例大肠癌病理分级Ⅰ级59 例，p53 基因突变27 例，突变率为45.76%；Ⅱ级41 例，p53 基因突变 21 例，突变率为51.22%；Ⅲ级35 例，p53基因突变25 例，突变率为71.43%。显示随细胞恶性程度的增高，p53 基因突变率增加，经统计学处理差异有显著性， P＜0.05(表3)。

表3　135 例大肠癌 p53 基因突变与病理分级的关系

　　2.2　大肠癌 p53 基因突变与分期的关系

　　135 例大肠癌中，Duke's A期18例，p53 基因突变6 例，突变率为33.33%；B 期48 例，p53基因突变19例，突变率39.58%；C期51例，p53基因突变34例，突变率66.67%；D期18例，p53基因突变14例，突变率77.78%。随分期升高，p53基因突变率增加，差异有极显著性，P＜0.01(表4)。

表4　大肠癌 p53基因突变与 Duke's 分期的关系

　　2.3　大肠癌 p53 基因突变与淋巴结转移的关系

　　135 例大肠癌中，66 例有淋巴结转移，检测到 p53基因突变45例，p53基因突变率为68.18%；无淋巴结转移者69例，检测到p53基因突变28例，p53基因突变率为40.58%。有无淋巴结转移p53基因的突变率差异有显著性， P＜0.01(表5)。

表5　135 例大肠癌中 p53 基因突变与淋巴结转移的关系

　　2.4　大肠癌p53基因突变与年龄的关系

　　135例大肠癌中，年龄≥50岁(高年龄组)79例，检测到p53基因突变34 例，突变率为43.04%；＜50岁(低年龄组)56例，检测到p53突变39例，突变率69.64%。低年龄组p53突变率明显高于高年龄组，经校正四格表χ²检验有显著意义，P＜0.05(表6)。

表6　135例大肠癌p53基因突变与年龄的关系

　　3　讨论　　p53 基因是一种抑癌基因，定位于17p^13.1染色体上，基因全长16～20Kb,由11个外显子、10个内含子及两侧的序列组成。野生型p53基因对细胞增殖起抑制作用，是重要的细胞生长负调节因子。而突变型p53基因则失去了细胞周期的负调控作用。

　　p53基因的突变和缺失与人类50余种肿瘤的发生、发展密切相关^［1］。大肠癌p53基因的突变率为39%～75%^［2，4］。

　　p53基因失活的方式有基因缺失、点突变和产物的表达降低，其中点突变是最常见的基因改变。突变的选择并不是随即分布的，近90%的p53基因突变集中在4个进化上高度保守区，即第5、6、7、8外显子。因此，检测这些外显子的突变将有助于评估p53基因的激活状态。

　　本研究中135例大肠癌p53基因的总突变率为54.07%，与文献报道基本一致^［4］。其中第5、6、7、8外显子的突变率分别为15.07%、20.54%、36.99%和27.74%，以第7外显子突变频率最高，第5外显子突变频率最低，但它们之间差异无显著性。其突变方式主要为点突变，另有部分呈缺失性突变。本研究结果证实在散发性大肠癌中p53基因突变在癌变的过程中可能起着重要的作用。

　　Yamaguchi 等认为，p53基因突变使细胞增殖活性明显提高，p53基因一旦突变将有可能导致细胞的恶性增殖^［5］。Bell等研究了100例大肠癌，显示p53突变率越高，细胞分化程度越差，p53基因突变与细胞恶性程度呈正相关^［6］。本研究中135例大肠癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期 p53基因突变率分别为45.76%、51.22%及71.43%，随分级的升高，p53基因突变率明显增加，差异有显著性(P＜0.05)，对比Ⅲ级和Ⅰ级 p53的突变率，差异则有极显著性。说明p53基因突变与细胞的恶性程度相关，检测p53基因的突变情况可以初步判定细胞的恶性程度。

　　p53基因突变后形成的p53蛋白由于构象改变失去了对DNA的亲和能力，使细胞从G₁期向S期的抑制作用减弱，细胞增殖能力加强，恶性程度升高。但也有少数学者认为，p53基因的突变与细胞分化程度无关，p53基因的突变只引起细胞的过度增殖，并不直接影响细胞的分化^［7］。我们的结论与多数学者的报道一致，p53基因的突变既可引起细胞的过度增殖，也影响细胞的分化程度。

　　Starzynske发现，p53蛋白表达和临床分期及大肠癌的早期复发和死亡率相关^［8］。Goh 等^［9］报道 Duke's C期大肠癌中p53基因点突变率明显高于Duke's A和 B期。Carson^［10］ 和 Baker^［11］ 等也认为p53基因的突变常发生于多阶段癌变的后期，即与肿瘤进展有关。与Goh、Carson等报道相反，Scott 和 Campo 等认为 p53基因的表达与临床分期及生存时间等无关^［7，12］。本研究 Duke's 分期中各期 p53基因突变率分别为 33.33%、39.58%、66.67%和77.78%，从A→D期p53基因突变率依次增高，差异有极显著性(P＜0.01)，显示p53基因突变与肿瘤进展有关，在肿瘤发展的过程中可能会产生新的p53基因突变。因此，p53基因不仅与大肠癌发生有关，更与大肠癌的发展及转归和预后直接相关。p53基因的突变贯穿于大肠癌发生发展的整个过程中，且在大肠癌的发展过程中起着更重要的作用，p53基因的突变应归属于大肠癌发生发展的晚期事件，检测p53基因的突变情况对判断大肠癌的预后将有很大帮助。

　　Coh 等研究认为，绝大多数结、直肠癌有p53基因突变，且发现p53基因突变促进癌细胞淋巴结转移，在187 例标本中，淋巴结受累伴p53突变的占70%，而淋巴结未受累p53突变仅占43%^［9］。Kastrinakis 等^［13］也在大肠癌肝转移灶中发现原发灶中没有的p53基因的突变。说明p53基因突变与淋巴结转移关系密切，p53的突变常发生在肿瘤发展或转移的过程中。本研究中，有淋巴结转移者p53基因的突变率为68.18%，而无淋巴结转移者p53基因的突变率为40.58%，两者之间差异有显著性(P＜0.01)，显示p53基因突变与大肠癌淋巴转移密切相关。

　　135 例大肠癌中，高年龄组的p53基因突变率为43.04%，而低年龄组的为69.44%，二者相比差异有显著性(P＜0.05)。这可能与低年龄组多病期较晚、淋巴转移较多及细胞分化较差有关。

　　参考文献：

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收稿日期：2000-09-28　修回日期：2000-10-20