大肠癌患者外周血中癌细胞检测的临床意义

中华实验外科杂志 1999年第3期第16卷 大肠外科

作者：骆成玉　李世拥

单位：100700　北京军区总医院普外科

　　关键词： 大肠肿瘤；微转移；外周血；细胞角蛋白20；逆转录-聚合酶链式反应

　　【摘要】　目的　探讨大肠癌患者外周血微转移的检测及临床意义。方法　以CK20非同位素RT-PCR方法，检测54例大肠癌患者术前和术后不同时间外周血中结肠癌细胞。结果　54例病人外周血中查出CK20阳性表达32例，阳性率59.63%，CK20阳性检出与Duke’s分期、淋巴转移存在差别有显著性。术后3天内外周血CK20阳性检出较术前多出3例，术后早期短程化疗结束后16例转阴。结论　大肠癌在早期就可能已累及全身，外周血中CK20的检测可帮助综合判断疾病恶性程度及患者预后，为指导辅助化疗提供了理论依据。术后早期短程化疗对控制大肠癌微转移具有一定的作用。

Detection of cancer cells in peripheral blood of patients with colorectal carcinomas and its clinical implication

LUO Chengyu, LI Shiyong.

　　General Hospital of Beijing Military Command, Beijing 100700

　　【Abstract】Objective To study the detection of micrometastasis in peripheral blood of patients with colorectal carcinomas and its clinical implication.Method Cytokeratin 20 (CK20) mRNA in peripheral boold of 54 patients with colorectal carcinomas was detected at various time points before and after operation by using non-isotope RT-PCR technique.Results The positive rate of CK20 mRNA in peripheral blood was 59.63%. The positive detection was significantly correlated with Dukes stage and liver metastasis. There were more 3 positive cases in 3 days of postoperation. After a short-term chemotherapy in the early stage of postoperation, 16 cases transformed from CK20 positive to negative.Conclusions The detection of CK20 in peripheral blood was helpful to the comprehensive judgment of malignant extent and prognosis. The short-term chemotherapy in the early stage of postoperation plays a role in controlling the micrometastasis of colorectal carcinoma.

　　【Key words】 Colorectal neoplasm Micrometastasis Peripheral blood Cytokeratin 20 PT-PCR

　　本研究旨在应用靶向CK20基因mRNA的非同位素逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，检测54例大肠癌患者术前和术后不同时间外周血中癌细胞，现报道如下。

　　对象与方法

　　1、病例　54例大肠癌患者，平均年龄58.32岁。男34例，女20例。于术前、术后3天内和术后早期短程化疗(术后第3天开始，表阿霉素50～70 mg第1天，丝裂霉素8～10 mg第2天，喃呋啶1.0 g第1～10天)结束后，从外周静脉分别抽取(注射器经DEPC水处理，去RNA酶)5 ml血液，肝素化。

　　2、引物　按文献报道［1］基因序列，由军事医学科学院生物工程研究所合成。CK20正义：5′-CAG-ACACACGGTGAACTATGG-3′，反义：5′-GATCAG-CTTCCACTGTTAGACG-3′；β₂-MG正义：5′-ACCC-CCACTGAAAAAGATGA-3′；反义：5′-ATCTTCAA-ACCTCCATAGTG-3′。

　　3、总RNA提取、cDNA合成及RT-PCR　根据我们以前报道的方法^［2］，设计β₂-MG作为内参对照，以证实所提取RNA足量、完整、可比，β₂-MG扩增产物(120 bp)与CK20扩增产物(370 bp)的电泳条带之间距离合适便于观察分析。反应产物行2%琼脂糖凝胶电泳、溴乙啶染色，紫外光下照相记录。

　　4、统计学方法　x²或Fisher检验。

　　结果

　　1、外周血CK20阳性检出与大肠癌临床病理　本组54例病人外周血中查出CK20 mRNA阳性表达32例，阳性率59.63%。CK20阳性检出与大肠癌分化程度差异无显著性(P＞0.05)，但与Dukes分期、淋巴转移间差异有显著性(P＜0.05，见表1)。

表1　外周血CK20阳性检出与大肠癌临床病理

　　2、术后不同时间外周血CK20阳性检出情况　术后3天内外周血CK20阳性检出35例，较术前多3例；术后早期短程化疗结束后，阳性检出仅19例，16例转阴。讨论

　　Burchill等^［1］以CK8、19、20系列mRNA作为靶RNA，采用同位素RT-PCR方法，仅仅对包括结肠癌在内的一组培养细胞株及正常志愿者的外周血和骨髓标本进行了检测，结果发现CK8、CK19在正常外周血中均有较高的阳性率，分别为88%(8/9)和40%(6/15)；CK20在正常外周血和骨髓中却均为阴性，而CK20在结肠癌细胞株中呈现阳性表达。所以，一旦结肠癌患者外周血或骨髓中CK20阳性就意味着癌细胞的存在。RT-PCR法具有细胞形态和免疫细胞化学技术不可比的敏感性，可以从10⁶～10⁷个正常组织细胞中检出一个肿瘤细胞^［3］，尤其适于微量肿瘤细胞的检测。本研究所用非同位素RT-PCR法，简便、快捷，避免了同位素使用的多种限制，更易被推广应用。

　　本研究结果表明，大肠癌病人外周血中具有较高的微转移率(59.3%)，即使是Dukes A期病人外周血微转移率已高达28.6%，随着疾病的进展，外周血微转移明显增加。有淋巴转移者，外周血微转移也较多。说明大肠癌在早期就已可能累及全身，外周血中CK20 mRNA的检测可帮助综合判断疾病恶性程度及患者预后。更重要的是，该检测对确定术后治疗方案、指导辅助化疗提供了理论依据，为尽量减少大肠癌复发和转移的机会，将起到重要作用。临床可根据大肠癌患者外周血中癌细胞的检出结果，进行针对性化疗。这样既可避免部分病人因不必要的化疗所带来的毒副作用，又可使一些真正高危病人得益于化疗，从而“有的放矢”。特别是对于DukesA患者，化疗的针对性尤为重要，并不是A期所有病人都不需化疗，部分病人确需化疗。

　　本组术后3天内对患者外周血的检测发现，术后较术前阳性检测增多3例，表明手术增加了大肠癌微转移的机会。因此，手术过程中应严格执行不接触隔离技术，最大限度地减少围手术“癌细胞医源性播散”的可能。

　　肿瘤细胞生物学特性研究证实，原发肿瘤切除后，由于反馈的关系，G₀期细胞大量进入增殖期，转移肿瘤细胞倍增时间缩短，生长迅速，而且术后早期负荷最小，对化疗也最敏感。因此，如果病人一般情况允许，化疗的实施宜尽早开始。本研究显示，术后早期短程化疗结束后，接近一半(45.7%)病人外周血中癌细胞被消除，表明术后早期短程化疗对控制大肠癌微转移具有一定的作用，有助于改善患者预后。如果此时不加处理，癌细胞势必增殖并危及生命，所以我们强调务必术后早期短程化疗。

　　参考文献

　　1　Burchill SA, Bradbury MF, Pittman K, et al. Detection of epithelial cancer cells in peripheral blood by reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Br J Cancer, 1995,71:278-281.

　　2　骆成玉，祝学光，王申五.大肠癌中p53基因mRNA表达的定量研究.中华实验外科杂志，1996，13：157-159.

　　3　Datta YH, Adams PT, Drobyki WR, et al. Sensitive detection of occult breast cancer by the reverse transcriptase-polymerase chain reaction. J Clin Oncol, 1994,12:475-483.

(收稿：1998-05-27　修回：1998-08-31)