肺癌胸腔积液p53基因测序的研究

中华结核和呼吸感染 1999年第5期第22卷 论著摘要

作者：顾其华　李玲芝　张贻秋　况艳春　叶爱慧　舒畅　曾滢

单位：418000 湖南省怀化市第一人民医院分子遗传研究室(顾其华、李玲芝、张贻秋、况艳春、叶爱慧)；湖南医科大学湘雅医院外科(舒畅)，遗传室(曾滢)

　　我们对38例患者癌性胸液及外周血均进行p53基因外显子7、8测序，报道如下。

　　对象与方法　(1)对象：38例肺癌并胸腔积液患者均经病理检查确诊，非小细胞肺癌31例，小细胞肺癌7例。男29例，女9例，吸烟者18例，年龄46～77岁，平均年龄53岁。非癌性胸液组31例，男23例，女8例，年龄37～63岁，平均年龄53岁，吸烟者19例，2组患者均无癌症家族史。310型测序仪、测序试剂盒，2400型热循环仪由美国PE公司生产，引物由中国医学科学院上海细胞所合成。(2)方法：①DNA提取：留10 ml新鲜胸液标本，离心取沉淀；抽外周血0.5 ml抗凝、溶血、离心取细胞核沉淀，均用蛋白酶K-消化缓冲液消化，再用苯酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。②目的基因扩增：引物序列，引物1：5′GTGTTGTCTCCTAGGTTGGCTCTGACTG3′，引物2：5′CTGTGGCTCCTGACCCGGAGTC-TTCCAG3′，引物3：5′ACCTATCCTGAGTAGTGGTAATCCTACTG3′，引物4：5′GTCCTGCTTGCTTACCTCGCTTAGTGCT3′。配制50μl反应体系。96℃预变性7分钟，94℃下加入Taq DNA聚合酶5 U，94℃变性30秒，55℃退火1分钟，72℃延伸2分钟。循环32次，72℃7分钟充分延伸。直接用双链产物作为测序模板^［1］。③序列测定：与扩增用同一对引物，分别从两端开始测序。配制20μl反应体系，96℃预变性20秒，96℃变性10秒，50℃退火5秒，60℃延伸4分钟，循环25次，序列用310遗传分析仪自动测定。

　　结果　31例非癌性胸液未发现p53基因突变。38例癌性胸液中发现第247位AAC向AGC、258位GAA向GTA突变各1例，第252位CTC和254位ATC两个密码子同时向TTC突变4例，第273位CGT向CAT突变5例。另发现257、258位间缺失3个bp1例，280～281位间缺失3个bp 1例，38例中共突变13例，其中检出点突变11例，3个碱基缺失2例。总阳性率达34%。38例肺癌患者外周血中仅发现5例阳性（胸液中同时有突变），阳性率为13%。二者差异有显著性(P＜0.05，χ²=4.66)。

　　讨论　据文献报道，肺癌组织中常见到p53基因失活，主要表现p53基因丢失或等位基因突变^［2］，可见于50％的非小细胞和75％的小细胞肺癌^［1］。我们对肺癌胸液标本p53基因第7和8两个外显子测序，38例中，总阳性率为34%，外周血标本仅发现5例突变阳性，占13%，二者差异有显著性，(P＜0.05)，说明用外周血标本检测临床意义不大，由于除273位等固定位点突变外，其他位点突变也不少见，直接测方法比其他基因诊断方法更准确。

　　本课题受湖南省卫生厅基金资助(基金编号：97100)

　　参考文献

　　1　Chiba I. mutations in p53 gene are frequent in primary resected non small cell lung cancer. Oncogene， 1990, 5:1603-1607.

　　2　Levine AJ. The p53 tumor suppression gene and product. Cancer Surv，1992,12:59-62.

(收稿：1998-07-10　　修回：1998-10-06)