诱导分化促进DNA损伤的肺癌细胞凋亡
中华结核和呼吸感染 1999年第5期第22卷 论著摘要
作者：司斌 刘志遐 靳桂明 王颖群 王润帮
单位：430070 武汉，广州军区武汉总医院
本试验的目的是探讨诱导分化剂和DNA损伤性化疗药对肺腺癌细胞凋亡的影响。
材料与方法 (1)材料：人肺腺癌细胞A549购自武汉大学典型培养物保藏中心，常规培养传代。诱导分化剂全反式维甲酸(RA)和DNA荧光染料hoechest 33258购自美国Sigma公司。原位细胞凋亡试剂盒购自德国宝灵曼公司。处理组细胞于传代后24小时细胞贴壁生长旺盛时加入依托泊甙(VP-16)，作用4小时后弃去药物，用含有或不含有RA的培养液继续培养72小时，同时设置空白及单药对照。(2)四甲基偶氮唑蓝(MTT)试验：参照Mosmann方法［1］，相对抑制率计算：1-处理组吸光度(A)值/对照组A值×100%，每次平行3孔，取平均值，至少重复2次，显著性检验用方差分析。(3)末端转移酶缺口标记(tunel)：按试剂盒说明书进行。细胞核显示棕黄色的为凋亡细胞，显微镜下计数阳性细胞的百分比，每个标本计算5个视野(至少200个细胞)，显著性检验用χ2检验。(4)流式细胞仪(FCS)细胞DNA含量和细胞周期分析：胰酶消化收集细胞，FACStar Plus流式细胞仪测定每个细胞的荧光强度，以此反应细胞的DNA含量，低于G1期DNA含量的细胞为凋亡，每个标本检测5 000个细胞，资料由ANALYSIS软件储存、分析并显示。(5)荧光显微镜下细胞核形态观察：收集处理好的细胞，Hoechst33258染色，置于荧光显微镜下，以红光激发，观察细胞核形态。
结果 (1)细胞生长抑制试验：如表1所示RA能增加对DNA损伤的肺癌细胞的生长抑制，生长抑制率比单用VP-
表1 不同浓度的RA和VP-16对肺癌细胞生长的抑制作用(
±s)
| RA浓度(μmol) |
VP-16(μmol) |
| 0 |
|
5 |
|
10 |
| A值 |
抑制率
(%) |
A值 |
抑制率
(%) |
A值 |
抑制率
(%) |
| 0 |
0.768±0.050 |
0 |
|
0.614±0.016 |
20 |
|
0.545±0.030 |
29 |
| 10 |
0.653±0.040 |
15 |
|
0.487±0.017*# |
36 |
|
0.461±0.025*# |
40 |
| 20 |
0.647±0.005 |
16 |
|
0.430±0.010*# |
44 |
|
0.413±0.057*# |
47 |
注：*与同浓度的RA相比P＜0.01，#与同浓度的VP-16相比P＜0.01
16组提高38%～120%。经方差分析，二药联合组与单药组和对照组差异均有显著性，F=70，P＜0.01。(2)tunel法原位细胞凋亡测定：单用VP-16 5 μmol与VP-16 5 μmol+RA 10 μmol和VP-16 5 μmol+RA 20 μmol组相比，细胞凋亡率从12%提高到40%和53%，是单药组的3.3～4.4倍。χ2≥82.35，P＜0.01。VP-16 10 μmol+RA 10 μmol和VP-16 10 μmol+RA 20 μmol组，细胞凋亡率分别是49%和66%，是同一浓度VP-16单药组的2.2～2.9倍，χ2≥63.45，P＜0.01。(3)流式细胞仪对凋亡细胞的定量分析：VP-16(5 μm)、RA(20 μm)和VP-16(5 μm)+RA(10 μm)组凋亡细胞率分别为8%，10%和22%。二药联合组是单药组的2.8倍(VP-16组)和2.2倍(RA组)。(4)细胞核形态观察：Hoechst33258染色荧光显微镜下，对照组细胞核显示均匀一致的绿色。处理组则可见到核染色质的固缩浓集，碎裂，凋亡小体形成。
讨论 不同类型的肿瘤有不同的凋亡诱导阈［2］，化疗和放疗的关键就在于触发和跨越这个阀。因此设法降低肿瘤细胞的凋亡阈，提高肿瘤细胞的凋亡率，是治疗的关键。我们比较了先用小剂量短时间VP-16处理肺癌细胞，造成DNA损伤，然后用含有或不含有RA的培养液继续培养72小时。结果显示，RA能增加对DNA损伤的肺癌细胞的生长抑制。通过荧光显微镜下细胞形态观察，流式细胞仪细胞DNA含量测定及细胞周期分析，和末端转移酶DNA缺口标记等多指标分析表明RA能促进DNA损伤的肿瘤细胞凋亡，诱导细胞凋亡率分别是单药组的2.8倍(VP-16组)和2.2倍(RA组)。
既往认为RA抑制肿瘤生长的机制是通过诱导分化和促进机体的免疫功能(如促进T淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和杀伤细胞的杀伤和吞噬作用)。我们曾报告RA在体外能诱导肺癌细胞凋亡，但需较大浓度［3］。本实验RA和DNA损伤性化疗药联合应用，使肺癌细胞的凋亡率提高数倍，同时减少了两者的用量，既能提高疗效又能降低副作用，为肿瘤的治疗提出了一个新的策略。此外RA促进DNA损伤的细胞凋亡，可防止细胞带着损伤的DNA进入有丝分裂期，从而防止基因突变和染色体畸变。
RA促进DNA损伤的肿瘤细胞凋亡的机制还不十分清楚，可能与其能调节某些癌基因和RA受体基因的表达有关［4］。
参考文献
1 Mosmann J. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 1983, 65:55-60.
2 Fisher DE. Apoptosis in cancer therapy: Crossing the threshold. Cell, 1994, 78:539-542.
3 司斌，刘志遐，张世明，等.维甲酸对肺腺癌细胞凋亡的影响.中华结核和呼吸杂志，1997，20：380.
4 Seewaldt VL, Johnson BS, Parker MB, et al. Expression of retinoic acid receptor β mediates retinoic acid-induced growth arrest and apoptosis in breast cancer cells. Cell Growth Diff, 1995, 6:1077-1088.
(收稿：1998-05-28 修回：1998-09-16)
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