人胰腺癌bcl-2基因的过度表达——免疫组织化学和原位杂交研究

肿瘤防治杂志 2000年第4期第17卷 基础研究

作者：王家林　申洪明　李胜

单位：王家林　申洪明　李胜(山东省肿瘤防治研究院　济南市　250117)

关键词：胰腺癌；免疫组织化学；mRAN原位杂交；bcl-2基因

　　【摘要】目的：应用地高辛标记bcl-2 cDNA进行mRNA原位杂交和免疫组织化学分析胰腺癌中bcl-2基因的mRNA转录和蛋白翻译，研究bcl-2基因结构和功能表达的关系。方法：以胰腺癌病人癌组织(50例)、胰腺癌转移灶组织(15例)为研究对象，采用免疫组织化学(SP法)和分子原位杂交法检测bcl-2在胰腺癌中的表达。对照组10例为慢性胰腺炎组织。结果：bcl-2蛋白在胰腺癌组明显高于胰腺癌转移灶组，Ⅰ、Ⅱ期、无转移、高分化的胰腺癌明显高于Ⅲ、Ⅳ期、有转移和低分化的胰腺癌。免疫组织化学与原位杂交技术检测胰腺癌组织中bcl-2基因表达结果一致。结论：bcl-2蛋白可能作用于胰腺细胞的癌变阶段，并与胰腺导管上皮癌变有关；bcl-2基因在mRNA和蛋白水平是相对稳定的。

　　中图分类号：R735.9　　文献标识码：A

　　文章编号：1009-4571(2000)04-0372-03

The Over-Expression of Bcl-2 in Pancreatic Cancer

WANG Jia-lin,SHEN Hong-ming,LI Shen

　　(Shandong Tumor Hospital & Institnte,Jinan 250117)

　　【Abstract】Objective:To investigate relations of bcl-2 gene's structure and function expression,the bcl-2 gene's mRNA transcription and protein translation in pancreatic cancer was analyzed immunohistochemically by the method of mRNA in site hybridization.Methods:The SP and molecular in site hybridization methods were adopted to detect the expression of bcl-2 in 50 cases pancreatic cancer tissue and 15 cases pancreatic metastases.10 cases of chronic pancreatitis tissues were used as control group.Results:The bcl-2 protein in pancreatic cancer group is patently higher than that in the pancreatic metastases group.ⅠorⅡstage,non-metastatic,highly-differentiated pancreatic cancer is patently lower than that in the Ⅲ or Ⅳ stage,metastatic,low-differentiated carcinoma. The result of bcl-2 gene's expression in pancreatic cancer detected by immunohist ochemical method is consistent with the result detected by in site hybridization method.Conclusions:Bcl-2 protein may take effect on the canceration stage of the pancreas cells and is related with the epithelial canceration of pancreas duct.Bcl-2 gene is relatively stable on mRNA and protein level.

　　【Key words】pancreatic cancer；immunohistochemics；in site hybridization；bcl-2 gene

　　bcl-2是细胞凋亡的重要抑制基因之一。目前国内外对bcl-2在胰腺癌中的研究较少。我们同时应用非同位素标记的mRNA原位杂交，结合免疫组16对胰腺癌及转移组织中bcl-2蛋白和mRNA的表达进行测定。对阐明bcl-2在胰腺癌发生、发展中的作用，揭示胰腺癌的分子机制有重要意义。

　　1　材料和方法

　　1.1　临床资料

　　收集1994年6月～1998年6月山东省肿瘤防治研究院胰腺病患者手术切除标本75例，其中胰腺癌50例，男33例，女17例，年龄10～72岁，平均年龄57.2岁。50例胰腺癌患者中胰头癌36例，胰体、尾8例，全胰癌6例；病理组织学分型包括胰腺导管癌35例，胰腺腺泡细胞癌15例，其中高分化癌29例，低分化癌21例；TNM分期Ⅰ期4例，Ⅱ期8例，Ⅲ期24例，Ⅳ期14例。15例胰腺癌转移病灶标本，男10例，女5例，年龄27～76岁，平均年龄55.1岁。被转移的器官有肝脏10例、大网膜5例。其中高分化癌5例，低分化癌10例。对照组10例全部为慢性胰腺炎病人。常规制作石蜡切片，厚4 μm，所有占蜡切片进行组织抗原微波修复^［1］。

　　1.2　方法

　　1.2.1　bcl-2 mRNA原位杂交　bcl-2 cDNA探针由美国Hopkins University的Ying Zhang博士惠赠。探针长度为0.8 kb,EcoR I酶切回收。应用地高辛随机引物法标记探针，方法和步骤依据Boehringer Mannheim公司的地高辛试剂盒操作流程进行。原位杂交操作流程参考Ehrlein^［2］所述的基础上进行进一步改进和完善。石蜡切片经二甲苯、乙醇梯度脱蜡→0.01 mol/L PBS洗→甘氨酸/PBS→TritonX-100/PBS→蛋白酶K消化，37℃，15 min。0.2 M HCl，室温10 min；乙醇：70%、80%、90%、100%各15 s，风干。预先将探针加入杂交液混勺，于90℃ 3 min加热变性，立即放入冰浴2 s。将含探针的杂交液滴加前处理切片，稍凉后用封口膜覆盖(湿盒中50%甲酰胺)42℃，20 h保温。将切片依此浸于5×SSC，2×SSC中(含50%甲酰胺)，30 min；2×SSC中，15 min，0.2×SSC，3 min×2次洗净；Dig缓冲液Ⅰ，5 min×2次。取放抗地高辛抗体的Ep管用Dig缓冲液Ⅰ1∶500稀释，37℃，30 min。将切片依此置于Dig缓冲液Ⅰ，15 min×2次；Dig缓冲液Ⅲ，3 min×2次。滴加显色剂(Dig缓冲液Ⅲ中加入BCIP和NBT)，37℃暗处孵育显色约30 min；自来水轻洗，甲基绿复染对比。bcl-2阳性杂交信号呈棕黄色，无杂交信号者为不表达或缺失。显微镜下观察，计数着色的细胞，注意着色部位和强度，以细胞中出现显色斑块/弥漫显色，或4个以上的显色颗粒定位阳性^［2］。以免疫组织化学染色切片为阳性对照。杂交前用Rnase 100 μg/m 137℃ 1 h预处理组织切片、去除相应探针和无抗地高辛抗体作为阳性对照。

　　1.2.2　免疫组织化学　鼠抗人bcl-2单克隆抗体:100，与bcl-2蛋白中41～54位氨基酸残基组成的14肽抗原决定簇反应，工作浓度1∶100。采用免疫组化染化SP(过氧化酶标记的链霉菌素-生物素)法^［3］。一抗、二抗及SP试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。取已知bcl-2阳性的大肠癌标本为阳性对照，阴性对照用PBS代替一抗，每例随机计数1 000个清晰的癌细胞，计算其阳性细胞比率。阳性染色细胞≥25%定为bcl-2阳性，即过度表达^［4］。

　　1.3　统计学方法

　　率的比较用卡方检验，样本＜40用Fisher精确计算法。

　　2　结果

　　2.1　免疫组织化学

　　bcl-2蛋白阳性染色呈棕褐色颗粒分布在细胞浆内(图1)。10例胰腺良性病变组中，8例导管上皮细胞染色阳性(80.00%)，胰腺癌组和胰腺癌转移灶组阳性细胞呈明显异质性，50例胰腺癌bcl-2蛋白阳性表达36例(72.00%)，低于胰腺良性病变阳性表达率，二者差异无显著性(P＞0.05)，15例胰腺癌转移灶bcl-2蛋白阳性4例(26.67%)，其阳性表达率明显低于胰腺癌，差异有显著性(P＜0.01)。bcl-2蛋白与胰腺癌临床病理特征的关系(表1)。

图1　胰腺癌中bcl-2蛋白染色阳性(SP法×400)

表1　bcl-2蛋白表达与胰腺癌临床病理特征关系

　　注：未注明P值者为P＞0.05。2.2　原位杂交

　　2.2.1　bcl-2 mRNA　50例胰腺癌中41例阳性。15例胰腺癌转移灶中阳性6例。阳性物质主要分布于肿瘤细胞的胞浆，间质细胞也有反应。棕黄色阳性反应细胞在癌组织中分布不均匀，显色也深浅不一。多呈散在片状或灶状分布。部分区域阳性细胞较多，部分区域则仅见单个阳性细胞。阳性反应细胞多位于癌巢边缘部分或管道近旁，癌巢周围则背景清晰无杂交信号(图2)。

图2　胰腺癌中bcl-2原位杂交染色阳性信号(×400)

　　2.2.2　胰腺癌组织中免疫组化和原位杂交两法检测结果比较　一致性检测(χ²)发现胰腺癌组织中bcl-2基因免疫组化和原位杂交结果关系密切(P＜0.05)。50例中两者结果一致者占66.00%(33/50)。同时发现两法的检查结果差异无显著性(P＞0.05)。

　　3　讨论

　　bcl-2基因是Tsjimoto等(1985年)在人类滤泡性淋巴瘤t断裂点发现的，是细胞凋亡的重要抑制基因，位于18q21，它的重排是染色体易位t(14:18)的结果，使18号染色体上的bcl-2基因与14号染色体上的免疫球蛋白重链(IgH)基因并列，形成头尾结构，引起bcl-2基因的连续过度表达，mRNA表达增加，影响到细胞凋亡，与肿瘤的发生和发展密切相关^［5］。

　　本研究系国内外首次同时应用非同位素标记mRNA原位杂交，结合免疫组化研究bcl-2基因在胰腺癌中的转录和翻译，并探讨该基因表达的调控机制。胰腺癌是目前治疗效果最差的恶性肿瘤之一，有文献报道其1年生存率不足12%，主要原因是多数胰腺癌病人在就诊时已是晚期，一些病人在接受胰十二指肠切除术时，已有局部或区域转移。除易于转移外，胰腺癌对化疗药物极度不敏感，非手术治疗效果不佳。因此近年来多数学者致力于胰腺癌的分子生物学研究。

　　本研究表现bcl-2蛋白在胰腺癌转移灶中的阳性率明显低于慢性胰腺炎、胰胰癌(P＜0.05)。bcl-2蛋白阳性表达与TNM分期有关，Ⅰ、Ⅱ期显著高于Ⅲ、Ⅳ期。无转移的胰腺癌bcl-2蛋白阳性表达率(82.56%)明显高于有转移的胰腺癌的阳性表达率(50.00%)，并有显著性差异(P＜0.05)。bcl-2表达特征与胰腺癌患者年龄和性别无关，与分化程度有关，高分化胰腺癌bcl-2蛋白阳性表达率明显高于低分化胰腺癌(P＜0.05)。以上结果表明，在肿瘤形成过程中，bcl-2基因过度表达使细胞凋亡受抑制，抑制机体的自身调节，突变细胞以生存；而癌肿一旦形成，bcl-2表达降低，细胞凋亡受抑制减少，癌肿得以异常增殖，这与saegasa等和Du等的观点相符^［6，7］。

　　本研究发现bcl-2基因在mRNA和蛋白水平上分布一致。阳性物质主要分布于肿瘤细胞的胞浆，间质细胞亦有反应。阳性反应细胞多位于癌巢边缘部分或管道近旁。

　　本实验用石蜡切片免疫组织化学与原位杂交技术检测胰腺癌组织中bcl-2基因表达情况，两法结果显示有显著的一致性。表明bcl-2基因在mRNA和蛋白水平是相对稳定的。其表达率的差异，可能由两个表达水平上的调控机制不平衡所致，推测某些细胞没有对mRNA进行有效翻译。

　　参考文献：

　　［1］石砚，李甘地，刘卫平.加热法复抗原的方法和应用进展［J］.临床与实验病理学杂志，1997，13(3)：265～266.

　　［2］Ehrlein J,Wanke R,Weis S,et al.Sensitive detection of human growth hormone m RNA in routinely formalin-fixed paraffin-embedded transgenic mouse tissue by non-isotopic in situ hybridization［J］.Histochem,1994，102:145～146.

　　［3］朱平，冯书章.抗体实验技术［M］.长春：长春出版社，1994，185～186.

　　［4］ Barhareschi M,Caffo O,Veronese S,et al.Bcl-2 and p53 expression in node-negative breast Carcinoma:a study with long-term follow-up［J］.Human pathol,1996,27(1):1149～1150.

　　［5］Tsujimoto Y,Cossman J,Jaffe E,et al.Involvement of the bcl-2 gene in human fouicular lgmphoma［J］.Science.1985,228:1440～1442.

　　［6］Saegua M,Takano Y,Hashimara M,et al.The possible role of bcl-2 expression in the progression of tumor of the uterine cervix［J］.Cancer,1995,76(11):2297～2299.

　　［7］Du M,Singh N,Husseuin A,et al.Positive correlation between apoptotic and proliferative indices in gastrointestinal lymphomas of mucosaoossociated lymphoid tissue(MACT)［J］.J Pathol,1996,178(4):377～378.

收稿日期：2000-04-23

修回日期：2000-05-08