鼻咽癌染色体3p21-26的等位基因杂合性丢失研究

中华肿瘤杂志 1998年第4期第0卷 基础研究

作者：邓龙文　江宁　谭国林　周鸣　湛凤凰　谢奕　曹莉　李桂源

单位：410078 长沙，湖南医科大学肿瘤研究所［邓龙文、江宁、谭国林、周鸣、湛凤凰、谢奕、曹莉、李桂源(课题负责人)］

　　关键词： 鼻咽肿瘤；染色体3p；等位基因；杂合性丢失

　　【摘要】　目的　细胞遗传学研究表明，3号染色体缺失是鼻咽癌常见的染色体异常之一。分子生物学研究表明，染色体3p在鼻咽癌中出现高频率的等位基因杂合性丢失(LOH)。本研究将进一步确定鼻咽癌3p等位基因杂合性丢失的频率及范围。方法　应用位于3p21-26区域16个微卫星多态性位点，对24例低分化鼻咽癌患者进行了LOH分析。结果　24例患者中有16例存在杂合性丢失(66.7%)。丢失频率最高的两个位点是D3S1560(50%，11/21)和D3S1620(50%，9/18)。在具有丢失的16例患者中，8例显示为1个连续的多个相邻位点的杂合性丢失区域，5例患者存在2个或2个以上的杂合性丢失区。病例1，3，4，7，8，10，16，17，18，19和22在D3S1597和D3S1297之间，表现为一个不同大小的杂合性丢失区。结论　最小共同丢失区位于D3S1560-D3S1620(3p25.3-26.2)之间，提示该区域有一个尚未克隆的、与晚期鼻咽癌明显相关的抑癌基因。

　　Allelic loss on chromosome 3p21-26 in nasopharyngeal carcinoma　　Deng Longwen, Jiang Ning, Tan Guoling, et al. Cancer Research Institute, Hunan Medical University, Changsha 410078

　　【Abstract】　Objective　To determine the frequency and extent of loss of heterozygosity (LOH) on chromosome 3p in nasopharyngeal carcinoma(NPC).Methods　Sixteen loci on chromosome bands 3p21-26 in 24 tumors was studied by using microsatellite analysis.Results　 LOH on 3p21-26 was found in 16 of 24 tumors (66.7%). The highest frequency of the allelic loss was found in two adjacent loci D3S1620(50%, 11/22) and D3S1560 (50%, 9/18). Eight cases showed LOH in one contiguous region and 5 cases in more than one region. Sample 1, 3,4,7,8,10,16,17,18,19, and 22 had a contiguous stretch of allelic loss between D3S1297 and D3S1597.Conclusion　The smallest common LOH/deletion region seems likely to lie between D3S1620(3p26.2-26.3) and D3S1560(3p25.3). The allelic loss map defined here will facilitate finer mapping of putative tumor suppressor gene loci and positional cloning of such genes, which may play a role in carcinogenesis of NPC.

　　【Subject words】　Nasopharyngeal neoplasms　　Chromosome 3p　　Alleles　　Loss of heterozygosity

　　鼻咽癌是一种常见于中国南方的上皮性恶性肿瘤。在湖南地区，鼻咽癌的标准死亡率为4.6×10^5［1］。流行病学研究表明，鼻咽癌的发病与EB病毒感染，某些环境理化因素及遗传因素有关。细胞遗传学研究发现，3号染色体结构异常是鼻咽癌一种常见的染色体异常之一^［2］。分子遗传研究也发现，鼻咽癌存在高频率的3号染色体短臂的等位基因杂合性丢失(Loss of heterozygosity, LOH)^［3～5］，其中3p25、3p14.3-21.1和3p14.3-24.1是其中丢失频率较高的染色体区域。为了进一步了解鼻咽癌3号染色体短臂等位基因杂合性丢失的频率及范围，更精确定位可能存在的鼻咽癌抑瘤基因的位置，我们采用16个位于3p21-26的微卫星多态性标记位点，对24例鼻咽癌患者进行研究。

材料与方法

　　1.标本：原发性鼻咽癌组织及其对应的外周血组织来源于湖南医科大学湘雅医院及附属第三医院的确诊鼻咽癌患者。采集标本时，患者未经放疗和化疗处理，24例标本均为低分化鳞癌。经病理检测估计其癌细胞含量在70%以上，其临床分期见表1(采用1987年UICC的TNM分类方法)。

　　2.DNA提取：采用蛋白酶k消化，苯酚、氯仿抽提法^［6］抽取癌组织及正常组织DNA，提取的DNA用TE缓冲液稀释至100 ng/μl并保存于4℃。

　　3.微卫星多态性分析：16对微卫星DNA序列

表1　24例患者的临床特点与染色体3p21-26杂合性丢失的关系

　　注：F为女性，M为男性　　+表示所检测的位点有一个或一个以上的LOH，-表示无LOH

　　引物均购自Research Genetics, Inc。40 μl PCR反应体系中含基因组DNA 200 ng，上、下游引物各0.2～0.4μmol/L；dNTP浓度为200μmol/L；缓冲液为10 mmol/L Tris-HCL，50 mmol/L KCL，1.5 mmol/L MgCL₂；1.5U Taq DNA聚合酶(华美公司)，经94℃60秒，55～60℃60秒，72℃ 2分钟反应35个循环，最后72℃延长10分钟。PCR产物95℃变性10分钟，上样于8%变性聚丙烯酰胺凝胶(含8 mol/L尿素)，1 000V电泳1～2小时后，在0.2%硝酸银溶液中染色10～15分钟，然后在1.5% NaOH和0.4%甲醛溶液中显影3～5分钟。将肿瘤组织与相应正常外周血DNA的PCR产物同时上样比较，若肿瘤组织中某一等位基因条带消失或相对密度减少50%以上，则判定为一个等位基因杂合性丢失。一些可疑的结果再重新进行PCR及电泳。

结果

　　染色体3p21-26的16个微卫星多态性位点分析结果见表2和附图。24例鼻咽癌中，16例患者在

表2　鼻咽癌染色体3p21-26的16个微卫星多态位点等位基因丢失频率

　　注：微卫星多态位点的染色体位置及顺序主要参考文献［7］

□表示杂合子无丢失；■表示杂合性丢失；N表示没有信息

　　附图　24例鼻咽癌患者染色体3p21-26的16个微卫星多态性位点等位基因杂合性丢失检测结果

　　D3S1270(3p26-ter)和D3S1076(3p21.1)之间表现出不同程度的等位基因杂合性丢失。即3p21-26等位基因杂合性丢失(LOH)在鼻咽癌中占66.7%(16/24)。

　　在具有LOH的病例中，2例在D3S1270-D3S1076之间所有杂合子均表现出丢失。8例患者表现为一个连续的LOH区域，5例患者中表现出两个或两个以上的LOH区域(附图)。LOH丢失频率最高的两个位点：D3S1620(3p25.1-26.1)，丢失频率为50%；D3S1560(3p25.1-25.3)，丢失频率为50%。在这两个位点的附近即D3S1297-D3S1620-D3S1560-D3S1597(3p25-26)区域，病例1，3，4，7，8，10，16，17，18，19和22表现为一个连续的等位基因丢失区，丢失的最小共同区域为D3S1620-D3S1560(附图)。

　　表2显示鼻咽癌患者的临床分级与3p染色体LOH之间的关系。可见其中8例没有LOH的患者，除1例为T₄N₀M₀外，其余均为T₂N_0-2M₀；而10例有LOH的患者为T₃N_0-3M₀，其他6例为T₂N_0-3M₀。LOH阳性患者中，临床Ⅲ～Ⅳ期要明显多于Ⅰ～Ⅱ期(P＜0.05，χ²检验)。

讨论

　　在许多肿瘤中均发现有3号染色体短臂缺失及等位基因杂合性丢失。3p25、3p21-22和3p14是肺癌最常见的缺失区；3p21-26和3p13-14是乳腺癌常见的缺失区^［8］。而鼻咽癌中染色体3p缺失及等位基因杂合性丢失，也是一种比较常见的异常。Huang等^［3］用限制性片段长度多态(RFLP)方法检测了Raf(3p25)和D3S3(3p14)位点，结果发现所有杂合子均表现为丢失。Lo等^［4］进一步用微卫星多态性技术检测到66.7%的鼻咽癌患者(18/27例)有3号染色体短臂等位基因杂合性丢失。LOH频率较高的位点为D3S1238(3p25，53%)，D3S1288(3p14.3，53%)和D3S1076(3p21.1, 47.4%)。Hu等^［5］最近报道显示LOH频率最高的位点为D3S1067(3p14.3-21.1，60%)和D3S1217(3p14-14.2，58%)，并且在D3S1297(3p26.2-26.3)位点发现1例有全部丢失。在本研究24例鼻咽癌患者中，我们检测了3号染色体短臂3p21-26区域16个微卫星多态性位点(平均遗传间距为5分摩)。结果显示，66.7%的患者有LOH。所检测的例数与LOH频率与以前的报道差异无显著性，LOH频率最高的位点为D3S1620(3p26)和D3S1560(3p25)。我们的研究结果一个显著特点是16例有LOH的患者中，10例在D3S1297至D3S1597区域表现出一个不同程度的连续的LOH区域，其中最小的共同缺失区位于D3S1620-D3S1560，即3p25.3-26.2。

　　位于染色体3p25并且已经克隆的抑瘤基因有VHL基因，是遗传性肿瘤Von-Hippal-Lindau综合征的易感基因。在散发性肾皮质肿瘤中，已检测出该基因所在位点高频率的LOH，并且50%的肿瘤细胞中有VHL基因的突变^［9］。然而该基因在12例鼻咽癌及鼻咽癌上皮细胞株中未检测到编码区域的突变^［10］。我们的LOH结果显示，VHL基因位于LOH高频率区D3S1620-D3S1560以外即D3S1597的近着丝粒一侧。因此，VHL基因不是鼻咽癌抑瘤基因，染色体3p26-25可能存在其他尚未克隆的抑瘤基因，并在鼻咽癌的发病中起作用。本研究为该基因的更一步定位及克隆提供了依据。

　　关于3号染色体短臂LOH与鼻咽癌临床分期之间的关系，Hu等^［5］报道临床Ⅲ～Ⅳ期与Ⅰ～Ⅱ期鼻咽癌比较，晚期患者3p的杂合性丢失程度更大。我们的结果也显示，LOH阳性患者中，临床Ⅲ～Ⅳ期要明显多于Ⅰ～Ⅱ期。也就是说，晚期的鼻咽癌患者更易发生3号染色体的LOH。因我们的样本数较少，要做出结论尚需进一步扩大样本数。

　　本课题受国家863项目和自然科学基金资助

参考文献

　　1肖剑云，李桂源，吴彭年，等. 湖南省鼻咽癌综合考察报告1973～1983. 医学研究资料(湖南医学院)，1986，26：1-40.

　　2邓龙文，姚开泰. 人鼻咽癌上皮细胞株HNE-1高分辨染色体显带分析. 癌症，1993，12：271-273.

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　　4Lo KW, Tsao SW, Leung SF. Detailed deletion mapping on the short chromosome 3 in nasopharyngeal carcinomas. Int J Oncol, 1994, 4: 1359-1364.

　　5Hu Li-Fu, Eiriksdottir G, Lebedeva T, et al. Loss of heterozygosity on chromosome arm 3p in nasopharyngeal carcinoma. Gene Chromo Cancer, 1996, 17: 118-126.

　　6Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. Preparation of genomic DNA from mammalian tissue. In: Molucular cloning: a Laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor(NY): Cold Sring Harbor Laboratory, 1989. 916-923.

　　7Naylor SL, Carritt B, Boileau C, et al. Report of the sixth international workshop on human chromosome 3. Cytogenet Cell Genet, 1996, 72: 255-270.

　　8Chen L-C, Matsumura K, Deng G, et al. Deletion of two separate regions on chromosome 3p in breast cancers. Cancer Res, 1994, 54: 3021-3024.

　　9Gnarra JR, Tory K, Weng Y, et al. Mutations of the VHL tumor suppressor gene in renal carcinoma. Nat Genet, 1994, 7: 85-89.

　　10Sun Y, Hildesheim A, Li H, et al. The von Hippel-Lindau(VHL) disease tumor-suppressor gene is not mutated in nasopharyngeal carcinoma. Int J Cancer, 1995, 60: 437-438.

(收稿：1997-11-26　　修回：1998-01-14)