用原位PCR方法检测鼻咽癌组织中的EB病毒

中华肿瘤杂志 2000年第1期第22卷 基础研究

作者：许亮国　杨旭宇　谢鹭　陈曲侯　王珣章　姚开泰

单位：许亮国（湖南医科大学卫生部癌变原理重点实验室，410078，长沙）；杨旭宇（湖南医科大学卫生部癌变原理重点实验室，410078，长沙）；谢鹭（湖南医科大学卫生部癌变原理重点实验室，410078，长沙）；陈曲侯（中山大学生命科学院，广州）；王珣章（中山大学生命科学院，广州）；姚开泰（湖南医科大学卫生部癌变原理重点实验室，410078，长沙）

　　关键词： 鼻咽肿瘤；爱泼斯坦-巴尔病毒；聚合酶链反应；原位杂交

　　【摘要】　目的　探讨在鼻咽癌组织石蜡切片标本中原位检测EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)的更灵敏的方法。方法　用地高辛标记的EBV DNA的BamHI-W片段为探针,分别用原位杂交、原位PCR的方法检测鼻咽癌组织切片中EBV的分布情况。结果　原位PCR比原位杂交检测EB病毒的方法更灵敏。结论　用原位PCR检测鼻咽癌组织切片中EB病毒不失为一种灵敏的方法。

Detecting Epstein-Barr virus in nasopharyngeal carcinoma tissue using in situ polymerase chain reaction

XU Liangguo, YANG Xuyu, XIE Lu, et al.

　　（ Key Laboratory of Carcinogenesis of Chineses Ministry of Public Health, Hunan Medical University, Changsha, 410078, China）

　　【Abstract】　Objective　To develop a sensitive non-isotopic method for in situ detection of Epstein-Barr virus (EBV) in paraffin-embedded section of nasopharyngeal carcinoma (NPC) tissue.Methods　The EBV BamHI-W fragment labeled with digoxigenin as probe was used to perform in situ hybridization and PCR in situ hybridization (in situ PCR).Results　The method of in situ PCR for the detection of EBV in NPC tissue was proved to be much more sensitive than in situ hybridization.Conclusion　Hybridization in situ of PCR product is useful to detect EBV in NPC tissues.

　　【Subject words】　Nasopharyngeal neoplasms; Epstein-Barr virus; Polymerase chian reaction; In situ hybridization

　　原位PCR（in situ polymerase chain reaction，ISPCR）始于90年代初期^［1,2］，目前，这一技术主要用来检测细胞内外源性DNA或RNA（主要是病毒）。病毒进入宿主细胞后,能在静止状态下保持很长时间甚至几年，细胞处于潜伏感染状态,病毒DNA 或RNA 的拷贝数低，用一般的原位杂交方法很难检测到病毒的存在，而原位PCR技术可以在组织中原位检测出低拷贝甚至单拷贝的病毒DNA或RNA序列，这对疾病作出早期诊断，对于发病机制的研究和疾病预防具有重要意义。原位PCR对研究艾滋病毒（human immunodeficiency virus，HIV）^［3］、人类乳头病毒（human papillomavirus，HPV）^［2］等多种病毒基因的隐性感染及发病机理等方面作出了巨大贡献，但目前尚未见有用原位PCR方法来检测EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）的报道，为此，我们就EB病毒的原位PCR检测方法作一探讨。

　　材料与方法

　　1.标本:由湖南省肿瘤医院病理科病理诊断为低分化鳞癌的鼻咽癌组织活检石蜡标本19例，慢性鼻咽炎标本6例。连续切片（厚4 μm）粘贴于经2% 3-氨基丙基三已氧硅烷（3-aminopropyltriethox-ysilane, APES）处理过的载玻片上，每例切取10片，分别用来做常规HE染色、原位杂交、原位PCR及阴性对照。

　　2.探针制备:EBV BamHI-W片段由重组的pBR322质粒中酶切回收，用dig DNA labeling and detecting kit (Boehringer Mannhein产品，Cat.No.1 093 657)进行标记。

　　3.原位PCR: 切片标本用二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，蛋白酶K消化处理。将反应混合物10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，50 mmol/L KCl，0.1% Triton X-100，4.5 mmol/L MgCl₂，200 μmol/L dNTPs，0.08% BSA，20 μmol/L 引物（EW1：5′-TTTGGAC-CCGAAATCTGA-3′；EW2: 5′-GCCCTGACCTTTGGTGA-3′； EW4: 5′-CAGCGACGGTGATGAAG-3′。EW1/EW2扩增产物长度为241 bp，EW1/EW4扩增产物长度为532 bp）充分混匀。根据标本大小，每块载玻片加反应混合液15～30 μl，0.15 U/μl Taq DNA聚合酶（华美公司产品），表面覆盖干净盖玻片，指甲油封边。无引物或无Taq DNA聚合酶作为阴性对照。玻片置MJ公司PTC-100型原位PCR仪上，94℃变性4 min后，94℃ 1 min、 55℃ 1 min、72℃ 1 min；35次循环。用解剖刀小心揭开盖玻片，浸入蒸馏水中。

　　4.原位杂交:原位PCR后，每片加10～30 μl杂交液（50%去离子甲酰胺、4×SSC、10% 硫酸葡聚糖、0.5 ng/μl Dig标记的探针）,加盖玻片，橡胶水封边。94℃变性8 min,42℃杂交过夜。未经原位PCR的相邻切片在玻片预处理后，直接滴加杂交液，行原位杂交做对照。杂交后，组织切片在2×SSC中移去盖玻片，然后用4×SSC，42℃洗3次，每次5 min；0.1×SSC,42℃洗3次，每次5 min。采用Boehringer Mannhein公司的Dig系统进行信号检测。产物为紫蓝色沉淀。

　　图1 显示NPC切片标本中EBV-W片段原位杂交结果 NBT染色 ×400 图2 显示NPC切片标本中EBV-W段原位PCR结果NBT染色 ×400。图1，2均为同一例EBV阳性的鼻咽低分化鳞癌的相邻切片

　　结果

　　在被检测的19例鼻咽癌组织标本中，原位PCR比原位杂交的信号要强，且阳性细胞数比原位杂交多，这说明原位PCR能大大提高原位检测EB病毒的敏感度。6例慢性鼻咽炎标本的原位杂交和原位PCR结果均为阴性。图1,2分别为同一例鼻咽癌标本相邻切片的原位杂交和原位PCR结果。

　　讨论

　　原位PCR是一项敏感性较高的检测细胞内特定DNA或RNA序列的新技术，其操作步骤较多，技术也较复杂，容易产生假阳性或假阴性。为此，设置适当的对照是很有必要的。在实验中，我们用同一标本的相邻切片不经过原位PCR直接进行原位杂交，在比较方法的同时，本身也是一组对照；在同一切片内EBV感染阴性的间质细胞或正常上皮细胞本身也是一种很好的阴性对照。通过这两者对照，很容易排除结果的假阳性。另外，我们采用的间接法原位PCR方法也能大大降低假阳性结果产生的可能性^［4］。我们用同一标本的相邻切片脱蜡后刮落下来行液相PCR，如果液相PCR结果为阳性而原位PCR为阴性，则提示原位PCR的结果很可能是假阴性，假阴性产生的原因，很可能是蛋白酶K消化不够，反应物不能很好地进入细胞内参与反应。有研究指出，原位PCR扩增产物必须超过350 bp才不致以扩增产物弥散^［1,5］，由于细胞内空间的障碍及标本制做过程中部分DNA或RNA会出现部分降解或断裂，扩增产物长度太大会影响扩增效率^［6］。我们在实验中用EW1/EW2引物对扩增241 bp的产物和EW1/EW4引物对扩增532 bp的产物都获得满意的原位扩增效果，没有出现扩增产物弥散现象，扩增效率也较高。

　　在原位PCR过程中，靶序列的充分暴露及试剂最大限度地进入细胞发挥作用应该是把握的关键。原位PCR反应体系中引物、Taq DNA聚合酶和Mg²⁺浓度比常规液相PCR要高些^［2,4］。我们实验的结果证明，对原位PCR反应影响最大的是Mg²⁺浓度，反应体系中采用4.5 mmol/L的Mg²⁺浓度时，扩增信号最强。

(本文图1，2见插页第1页)

　　基金项目：国家自然科学基金重点资助项目（39730200）

　　参考文献：

　　［1］　Haase AT, Retzel EF, Staskus KA. Amplification and detection of lentiviral DNA inside cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87:4971-4975.

　　［2］　Nuovo GJ, Gallery F, Macconnel P, et al. An improved technique for the in situ detection of DNA afteer polymerase chain reaction amplification. Am J Pathol, 1991, 139: 1239-1244.

　　［3］　Bagasra O, Hauptman SP, Lischner HW, et al. Detection of human immunodeficiency virus type I provirus in mononuclear cells by in situ polymeerase chain reaction. N Eng J Med, 1992, 326:1385-1391.

　　［4］　Long AA, Komminoth P, Lee E, et al. Comparison of indirect and direct in situ polymerase chain reaction in cell preparations and tissue sections, detection of viral DNA gene rearrangements and chromosomal translocations. Histochemistry, 1993, 99:151-162.

　　［5］　Komminoth P, Long AA, Ray R, et al. In situ polymerase chain reaction detection of viral DNA, single-copy genes and gene rearrangements in cell suspensions and cytospins. Diagn Mol Pathol, 1992, 1:85-97.

　　［6］　Stanta G, Schneider C. RNA extracted from paraffin-embeded human tissues is amenable to analysis by PCR amplification. Biotechniques, 1991, 11:304-308.

收稿日期：1999-02-05