膀胱肿瘤中p53、p21、C-erbB-2癌基因表达及T细胞亚群研究
中国免疫学杂志 1999年第10期第15卷 肿瘤免疫学
作者：那万里 尹文京 周鹤年
单位：尹文京 吉林省人民医院外科，长春 130021；周鹤年 乾安县人民医院外科；那万里 白求恩医科大学第三临床学院泌尿外科，长春 130021
关键词：膀胱癌；癌基因；T细胞亚群
摘 要 目的：探讨p53、p21、C-erbB-2表达与膀胱癌生物学行为的关系以及膀胱癌患者外周血T淋巴细胞亚群的变化。方法：应用免疫组化LSAB(Labelled Strept Adin Bidin)技术，检测膀胱癌相关癌基因p53、p21、C-erbB-2的基因表达。结果：p53、p21、C-erbB-2阳性表达率随病理分级上升而上升；浸润性癌p53、p21、C-erbB-2的阳性表达强度高于浅表性癌；阳性表达的术后癌复发率明显高于阴性表达，阳性表达的死亡率亦高于阴性表达者。T细胞亚群中OKT4/OKT8、Et、Ea数随肿瘤分级而下降，而OKT8值则逐渐升高。结论：证明p53、p21、C-erbB-2基因与肿瘤生物学行为之间存在密切关系，细胞免疫功能在肿瘤的发生、发展中起着一定的作用。
中国图书分类号 R730.3
The expression of p53，p21，C-erbB-2 gene and immunological
study in bladder cancer
NA Wan-Li,YIN Wen-Jing,ZHOU He-Nian.
Department of Urology,Third Teaching Hospital,Norman Bethune University of Medical Science,Changchun 130021
Abstract Objective:To investigate the association between the positive expression and biological behavior.Method:This approch has applied immunohistochemistry LSAB method,examining the gene of p53，p21，C-erbB-2 among bladder cancer cases.Results:Positive expression of genes of p53，p21 and C-erbB-2 increased with increasing of pathological grade.p53，p21 and C-erbB-2 positive patients postoperative survival rates are lower than negative expressive patients.The subset of T lymphocyte changed in bladder cancer:OKT4+.OKT4＋／OKT8+,Et,Ea decreased;OKT8+ increased.Conclusion:All these results demonstrated that the p53，p21 and C-erbB-2 activation play an important role in bladder cancer's progression and may serve as an important index to evaluate the degrees of bladder cancer.Further more some T cell subset may play some role in bladder cancer.
Key words Bladder cancer Oncogene T cell subset
膀胱癌是肿瘤中常见的一种，占全身肿瘤的1.62%～4.40%［1］，占泌尿系肿瘤的40%～60%［2］。其发病率随年龄增加而增加，近年有逐渐上升趋势。膀胱肿瘤的异质性使其按行态学的分级、分期难以全面概括或解释某一肿瘤的生物学行为。仅靠大体类型和镜下病理估计预后及生物学行为也不十分可靠。因此寻找新的标记物为临床提供最佳方案是目前急待解决的问题。
癌基因及蛋白产物的研究一直是肿瘤学和分子生物学的研究热点。其中癌基因p53、p21、C-erbB-2的表达与膀胱癌的生物学行为有密切的关系。本文应用免疫组化LSAB(Labelled Strept Adin Bidin)法，检测40例膀胱癌标本中p53、p21、C-erbB-2基因表达，结合病理分组、复发及预后，探讨p53、p21、C-erbB-2阳性表达与膀胱癌生物学行为的关系［3～5］。
肿瘤的发生与机体免疫功能有关，尤其是细胞免疫功能有关。本文在对癌基因研究的同时，对膀胱癌患者术前、术后外周血T淋巴细胞亚群、Et、Ea进行了测定。
1 材料与方法
1.1 病例选择 选择膀胱移行细胞癌：男性30例，女性10例；年龄15～80岁，平均55岁。另取10例正常膀胱组织标本作对照组。
1.2 标本处理 所有标本经石蜡包埋，作4 μm连续切片，1份重新作HE染色以核实诊断；另3份作p53、p21、C-erbB-2染色。
1.3 免疫组化LSAB法
1.3.1 方法 ①用1∶50丙酮浸泡载玻片，以防脱片。②用3%H2O2处理切片以灭活内源性酶。③用0.01 mol/L柠檬酸盐处理p53、p21切片，经加热、冷却后进行下一步。④p53、p21切片滴加抗原修复液；C-erbB-2滴加复合消化液。⑤加封闭液。⑥分别向3张切片加小鼠抗p53、p21、C-erbB-2蛋白抗体。⑦加山羊抗小鼠IgG。⑧加APA-兔抗山羊IgG。⑨DAB染色。⑩苏木素轻度复染，直到切片呈蓝色。
1.3.2 结果判定标准 p53蛋白产物显色特点：光镜下见膀胱癌细胞核染成棕黄色，部分胞浆亦被染色，阳性细胞在癌组织内呈局灶性分布。p21蛋白产物显色特点：光镜下见显色多位于胞浆内，为棕黄色，胞膜亦有着色，显色过强时呈棕褐色，可见细小及粗大颗粒。C-erbB-2蛋白产物显色特点：光镜下见显色多位于胞浆内，为棕黄色，大多数为片状分布，少数为局灶性及弥漫性分布。
1.4 T淋巴细胞亚群的检测 采用间接免疫荧光法(IFA)，用OKT11、OKT4和OKT8抗体对病人组和对照组外周血淋巴细胞进行染色。OKT11识别全部成熟T淋巴细胞和NK细胞。OKT4识别辅助性T细胞亚群，OKT8识别抑制性T淋巴细胞亚群。
1.5 Et花环及Ea花环检测 见参考文献［6］。
2 结果
2.1 p53、p21、C-erbB-2表达与膀胱癌病理分级 从表1可以看出p53、p21、C-erbB-2阳性表达率均随病理分级的上升而明显增加；Ⅰ级与Ⅱ级、Ⅲ级；Ⅱ级与Ⅲ级之间有显著性差异(P＜0.05)。并且p53、p21、C-erbB-2阳性程度也随病理分级上升而增强，经χ2检验相关分析，均为P＜0.05。
2.2 p53、p21、C-erbB-2阳性表达与膀胱癌复发的关系 本实验检测40例标本中(见表2)除行膀胱全切3例外，复发21例，未复发16例。从结果中可以看出阳性表达的复发率明显高于阴性表达复发率。
2.3 p53、p21、C-erbB-2表达与膀胱癌预后 本实验组死于该肿瘤17例。p53阳性者死亡率为71.4%(15/21)，而阴性者死亡率为31.5%(6/19)；p21阳性者死亡率为77.2%(17/22)，阴性者死亡率为31.8%(7/22)，见表3。
2.4 外周血T淋巴细胞亚群、OKT4/OKT8比值及Et、Ea花环 从表4中可以看出，随着肿瘤分级的升高其OKT4、OKT11、OKT4/OKT8、Et、Ea数值逐渐下降，而OKT8值则逐渐升高。
表1 p53、p21、C-erbB-2表达与病理分级的关系
Tab.1 Expression of p53，p21，C-erbB-2 genes and pathological grade
| Pathological
grade |
p53 |
p21 |
C-erbB-2 |
| |
＋ |
 |
 |
Total(%) -Total(%) |
+ |
|
|
Total(%) |
-Total(%) |
＋ |
|
|
Total(%) |
-Total(%) |
| Ⅰgrade |
2 |
1 |
0 |
3(30.0) 7(70.0) |
2 |
2 |
0 |
4(40.0) |
6(60.0) |
0 |
2 |
1 |
3(30.0) |
7(70.0) |
| Ⅱgrade |
1 |
3 |
5 |
9(50.0)1) 9(50.0) |
2 |
4 |
2 |
8(44.4) |
10(55.6)1) |
1 |
2 |
5 |
8(44.4) |
10(55.5) |
| Ⅲgrade |
0 |
3 |
6 |
9(75.0)1)2) 3(25.0) |
1 |
3 |
6 |
10(83.3) |
2(16.6)1)2) |
1 |
2 |
4 |
7(58.3) |
5(41.7) |
| Total |
3 |
7 |
11 |
21(52.5) 19(47.5) |
5 |
9 |
9 |
22(55.0) |
18(45.0) |
2 |
6 |
10 |
18(45.0) |
22(55.0) |
Note:1)Ⅰgrade compared to Ⅱ，Ⅲ grade P＜0.05；2)Ⅱ grade comparcd to Ⅲ grade， P＜0.05
表2 p53、p21、C-erbB-2表达与疾病复发的关系
Tab.2 Expression of p53，p21，C-erbB-2 genes and recrudesce
| |
Positive |
Negative |
P |
| p53
p21
C-erbB-2 |
57.1%(12/21)
61.9%(13/21)
47.6%(10/21) |
12.5%(2/16)
18.7%(3/16)
18.7%(3/16) |
＜0.01
＜0.05
＜0.01 |
表3 p53、p21、C-erbB-2表达与膀胱癌预后的关系
Tab.3 Expression of p53，p21，C-erbB-2 genes and survival rates
| |
Case |
Positive(%) |
Survival rates and death rates |
| 1 year
(%) |
Survival |
Death |
3 year |
Survival |
Death |
5 year
(%) |
Survival |
Death |
| p53 |
21 |
52.5
(1.40) |
85.7
(18/21) |
18 |
3 |
38.0
(8/12) |
8 |
13 |
28.5
(6/21) |
6 |
15 |
| p53 |
19 |
47.5
(19/40) |
89.4
(17/19) |
17 |
2 |
64.7
(16/19) |
16 |
3 |
66.4
(13/19) |
13 |
6 |
| p21 |
22 |
55.0
(22/40) |
81.8
(18/22) |
18 |
4 |
54.5
(12/22) |
12 |
10 |
22.7
(5/22) |
5 |
17 |
| p21 |
18 |
45.0
(18/40) |
88.8
(16/18) |
16 |
2 |
77.0
(14/18) |
8 |
10 |
22.2
(4/18) |
4 |
14 |
| C-erbB-2 |
18 |
45.0
(18/40) |
72.2
(13/18) |
13 |
5 |
44.4
(1/18) |
8 |
10 |
22.1
(4/18) |
4 |
14 |
| C-erbB-2 |
22 |
55.0
(22/40) |
81.8
(18/22) |
18 |
4 |
68.1
(15/22) |
15 |
7 |
66.1
(15/22) |
15 |
7 |
表4 外周血T淋巴细胞亚群T4/T8比值及Et、Ea花环
Tab.4 T lymphocyte sub-population ratio of T4/T8 and Et，Ea
| |
Control |
Ⅰgrade |
Ⅱgrade |
Ⅲgrade |
| OKT11±(%) |
68.07±3.58 |
65.71±4.77 |
65.70±4.96 |
63.66±3.90 |
| OKT4±(%) |
48.66±3.14 |
46.24±4.34 |
44.66±4.38 |
42.65±6.48 |
| OKT4±/OKT8± |
1.54±0.23 |
1.31±0.19 |
1.30±0.13 |
1.22±0.18 |
| Et(%) |
68.60±8.27 |
68.30±8.22 |
67.63±7.02 |
63.75±6.55 |
| Ea(%) |
36.15±7.55 |
33.87±6.05 |
33.87±6.15 |
31.75±5.87 |
3 讨论
p53基因为抑癌基因，其生化功能为转录因子，生物学功能为G1期DNA损坏的检查点，p53可以与肿瘤病毒癌蛋白结合失活，也可通过点突变、丢失、重排等形式而失活，失活的p53功能丧失，当细胞受外界环境致癌物作用时，DNA损伤不能修复，遗传不稳定，突变积累，重排加快，促进细胞向恶性转变［4］。p21参与细胞周期调控是通过p53基因实现的。当DNA损伤时p53水平提高，诱导p21合成。诱导合成的p21与细胞周期蛋白/抑制蛋白复合物结合，抑制细胞周期蛋白活性，细胞周期停止，修复功能增强。当p53突变时，p21不被诱导，修复DNA的可能性减少，随之获得染色体异常的可能性增加，因此更倾向于形成肿瘤［3］。C-erbB-2又称neu基因，编码一个185 kD的蛋白，与表皮生长因子受体十分近似，该基因通过基因扩增和蛋白产物的过度表达而与人类肿瘤发生有关［5，7］。本实验的结果提示：p53基因突变与肿瘤的生物学行为之间存在着密切关系，是低分化、侵袭性的重要特征。p21与p53关系密切，均与病理分级相平行。C-erbB-2蛋白产物的表达和膀胱癌的分级、分期、预后相关，可作为膀胱癌恶性倾向的评估指标。
T细胞为抗癌免疫反应的核心细胞，成熟T细胞为TCR T细胞，主要为CD4和CD8两大亚群。CD4 T细胞不仅在初始抗癌免疫中行使强有力的调节作用，在抗癌免疫记忆反应中更为重要，且可参与靶细胞的直接杀伤。CD8 T细胞除行使杀伤效应外，亦具有强烈的调节效应而参与肿瘤免疫［8］。本研究的结果表明：膀胱癌患者外周血T细胞亚群的分布异常，即CD4 T细胞降低、CD8 T细胞增高、CD4/CD8比值降低，同时Et、Ea数值逐渐下降。这种细胞免疫功能的改变提示细胞免疫与膀胱癌有着相关性，是机体原有的免疫功能异常导致肿瘤发生，还是肿瘤引起了免疫功能改变，还有待进一步研究。
至于p53、p21、C-erbB-2基因表达异常与细胞免疫的相互关系可能是，一、这三种基因表达异常，引起组织癌变，进而导致细胞免疫功能的变化。二、细胞免疫异常，免疫监视功能减弱，致使p53、p21、C-erbB-2基因表达异常。对p53/p21/C-erbB-2基因表达、细胞免疫状态、膀胱癌相互关系的探讨及机理的研究，将有助于膀胱肿瘤的预防、诊断和治疗。
作者简介：那万里，男，38岁，泌尿外科副主任医师，副教授，主要从事膀胱肿瘤的分子生物学研究
参考文献
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收稿1998-06-23 修回1999-06-23
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