细胞粘着分子CD₄₄V₆在膀胱肿瘤中的表达

临床泌尿外科杂志 2000年第12期第15卷 实验研究

作者：李文洲　陈晓春　张齐钧

单位：李文洲 陈晓春（武汉市第二医院泌尿外科 武汉，430014）；张齐钧（同济医科大学附属协和医院泌尿外科）

关键词：细胞粘着分子；膀胱肿瘤；荧光免疫测定

　　摘要　目的：探讨细胞粘着分子CD₄₄V₆在膀胱肿瘤中的作用及其临床意义。方法：利用免疫荧光法检测了28例膀胱肿瘤和5例正常膀胱移行上皮组织中CD₄₄V₆的表达情况。结果：浸润型膀胱肿瘤组织CD₄₄V₆阳性表达率为44.44%和75.00%，浅表型膀胱肿瘤阳性表达率为13.33%(P＜0.05)，正常组织均阴性表达。半定量检测分析显示CD₄₄V₆的表达水平与肿瘤的分级和分期相关。结论：CD₄₄V₆的检测是一种提示肿瘤浸润和预后有实用价值的诊断指标。

The expression of CD₄₄V₆ protein in bladder cancer

LI Wen-zhou

　　(Department of Urology,the Second Hospital,Wuhan ,430014)

　　ZHANG Qi-jun　CHEN Xiao-chun

　　(Deparment of Urology,the Affiliated Xiehe Hospital,Tongji Medical University)

　　Abstract　Purpose:To investigate the expression and significance of CD₄₄V₆ adhesion molecule in human bladder tumor tissue. Methods:We examined the expression of CD₄₄V₆ Protein in 28 bladder transitional cell carcinomas and 5 normal urinary transitional epithelial tissues by immunofluorescence using CD₄₄V₆ specific antiboby. Results: 7 of 13 invasive TCCs were positive staining and 2 of 15 superficial TCCs positive(P＜0.05).In contrast, 5 normal tissues were negative. Semi-quantitative analyses revealed that up regulation of CD₄₄V₆ protein expression correlated with high tumor grade and stage. Conclusions:Evaluation of CD₄₄V₆ protein expression may be a useful diagnostic parameter indicating invasive processes and progress with poor prognosis.

　　Key words　Cell adhesion molecules　Bladder neoplasms　Fluoroimmunoassay

　　细胞粘着分子CD₄₄是一类分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，在人类正常的淋巴细胞、成纤维细胞和一部分上皮细胞上均有表达，属粘着分子中选择素家族中的一员，主要参与细胞与细胞、细胞与基质间的粘连^〔1〕。近年来，人们在许多人类肿瘤细胞表面已检测到CD₄₄的表达，并发现CD₄₄的表达与肿瘤的发生、发展有关，尤其是近几年发现的倍受人们观注的CD₄₄的变异拼接体V₆(CD₄₄V₆)在多数人类肿瘤细胞上都有表达，其表达水平与肿瘤的生物学特性有着十分密切的联系^〔2〕。甚至有人将CD₄₄V₆视为一种判断肿瘤的发生、发展及其预后的临床检测指标。为探讨CD₄₄V₆在膀胱肿瘤中的作用及其意义，我们对CD₄₄V₆在膀胱肿瘤中的表达进行了研究，现将结果报告如下。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本来源

　　本文28例膀胱肿瘤标本均取自手术切除的新鲜组织，经常规病理切片证实为膀胱移行细胞癌。其中男25例，女3例，年龄30～78岁，平均61.4岁。病理分级按WHO标准分为G₁17例(G₁组)，G₂10例(G₂组)，G₃1例(G₃组)，临床分期按UICC拟定的分期标准分为T_a-115例(T_a-1组)，T₂9例，T₃4例(T₂加T₃组)。此外，另取5例非肿瘤患者的膀胱组织作为正常对照组。

　　1.2　标本制备

　　将手术切除的新鲜组织迅速置于液氮中速冻，再置于-70℃低温冰箱中保存。用冷冻切片机切出5 μm切片，用丙酮固定10 min，风干，置于4℃冰箱中保存备用。

　　1.3　检测方法

　　一抗CD₄₄V₆单抗(兔)购自武汉博士德生物工程有限公司(美国Calbiochem-Novabiochem公司产品)，二抗荧光抗体(羊抗兔)为武汉生物制品研究所产品。

　　将风干切片用10%小牛血清封闭，加一抗置于4℃冰箱中过夜，再加二抗，用德国产Leitz荧光显微镜观察并摄片。

　　1.4　结果评估

　　定性检测：在高倍镜视野下，肿瘤细胞膜荧光着色者为阳性，未着色者为阴性，计阳性率。半定量检测：每个阳性病例等距抽样选择10个高倍镜视野，并计算阳性细胞数。按肿瘤的不同分期和分级，分别计其阳性细胞平均数值。

　　1.5　统计学处理

　　各组间阳性率的比较采用χ²检验，各组间阳性细胞均数比较采用F分析。

　　2　结果

　　2.1　定性检测结果

　　详见表1。

　　2.2　半定量检测结果

　　各组检测结果见表2和表3。

表1　临床分期各组间CD₄₄V₆阳性率的比较

　　χ²检验，P＜0.05

表2　病理分级各组间阳性细胞数均值的比较

组别	标本	自由度(n)	均值	标准差(s)
G1	3	30	21.80	9.57
G2	5	50	29.68	11.42
G3	1	10	39.30	11.81

　　各组间比较差异有极显著性意义(P＜0.01)

表3　临床分期各组间阳性细胞数均值的比较

组别	标本数	自由度(n)	均值()	标准差(s)
Ta-1	2	20	17.70	7.429
T2	4	40	27.25	9.515
T3	3	30	36.23	11.866

　　各组间比较差异有极显著性意义(P＜0.01)　　从上述结果可以看出，浸润型膀胱肿瘤(T₂和T₃)的CD₄₄V₆阳性率(44.44%和75.00%)明显高于浅表型膀胱肿瘤(T_a-1)的阳性率(13.33%)，而正常对照组均为阴性表达。半定量检测分析显示CD₄₄V₆的表达水平随膀胱肿瘤病理分级和临床分期的增高而升高。

　　3　讨论

　　人类CD₄₄编码基因位于第11号染色体短臂上。人们利用PCR技术和酵母人工染色体克隆技术研究发现CD₄₄基因至少含有20个外显子^〔3〕。含有10个固定组成型外显子的转录子称为标准型的CD₄₄(即CD₄₄S)，由它编码的成熟蛋白含有361个氨基酸，其分子量为80 000～90 000。含有V区(即插入区)变异拼接外显子的转录子统称为CD₄₄V，其蛋白表达产物的分子结构多样复杂，且分子量较CD₄₄S大，一般为140 000～160 000，少数可高达215 000^〔1〕。近年来，人们研究发现在CD₄₄拼接变异体中，以CD₄₄V₆最为多见。在人类的乳腺癌、结肠癌、胃癌、肾癌等中均能检出CD₄₄V₆异常表达，并发现它与肿瘤细胞分化、肿瘤的浸润转移有关^〔4〕。而且在许多体外培养的肿瘤细胞系上，人们也检测到了CD₄₄V₆表达，并发现其表达水平与肿瘤细胞的恶性程度和转移潜能呈正相关^〔5，6〕。

　　本文研究发现，在28例膀胱移行上皮癌中，有32.14%的标本有CD₄₄V₆阳性表达。特别值得注意的是，在浸润型膀胱肿瘤中(T₂和T₃)，CD₄₄V₆的阳性率(44.44%和75.00%)明显高于浅表型膀胱肿瘤(T_a-1)中的阳性率(13.33%)。由此提示CD₄₄V₆的表达可能与肿瘤的恶性表型有关，恶性程度高，其阳性表达率亦高。Woodman等^〔7〕亦有类似的结论。Kan等^〔8〕利用Southern斑点原位杂交技术，从基因水平检测膀胱肿瘤中CD₄₄V₆的表达情况，发现CD₄₄V₆阳性表达率高达81.8%。这可能是因为他们的检测方法更为敏感、精确，也可能是因膀胱肿瘤中CD₄₄V₆在基因水平和蛋白水平的表达存在着差异的缘故。

　　我们在研究中还利用半定量的检测方法，比较了各病理分级和临床分期间CD₄₄V₆蛋白的阳性细胞数，发现CD₄₄V₆阳性细胞数随着肿瘤的分级和分期的增高而升高。这进一步提示CD₄₄V₆的表达水平与膀胱肿瘤的细胞分化程度、肿瘤浸润程度有关，我们推测CD₄₄V₆的表达可能是评价膀胱肿瘤恶性程度和预后的一种新的临床检测指标，对我们临床诊断、治疗及预后有一定的指导意义。

　　在膀胱肿瘤的早期诊断和筛选中，尿脱落细胞学检查是一项十分重要的手段。近年来，有人利用RT-PCR技术检测膀胱肿瘤患者尿脱落细胞中CD₄₄V₆基因的表达情况，发现其阳性检出率为71.5%^〔9〕。我国吴忠等^〔10〕也作过类似研究工作，其阳性检出率更高达90%。这些结果都明显高于尿脱落细胞学的阳性检出率(60%)。因而，他们认为这种检测方法不仅具有尿脱落细胞学的快速、简便、无创伤的优点，同时也明显提高了检出膀胱肿瘤患者的敏感性，是一种较有潜力的新的检测手段。

　　参考文献

　　1，Haynes B F,Marilyn J T,Laura P H,et al.CD₄₄-A molecule involved in leukocyte adherence and T-cell activation.Immunol Today,1989,10:423～426

　　2，Matsumura Y,Tarin D.Significane of CD₄₄ gene products for cancer diagnosis and diease evaluation.Lancet,1992,340:1053～1055

　　3，Screaton G R,Bell M V,Jackson D G,et al.Genomic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD₄₄ reveals at least 12 alternatively spliced exons.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:12160～12161

　　4，Gunthert U,Stauder R,Mayer B,et al.Are CD₄₄ variant isoforms involved in human tumor progression?Cancer Surv,1995,24:19～42

　　5，Stevens J W,Palechek P L,Griebling T L,et al.Exprssion of CD₄₄ isoforms in human prostate tumor cell lines.Prostate,1996,28:153～161

　　6，Gunthrt U,Hofman M,Rudy W,et al.A new variant of glycoprotein CD₄₄ cofers metastatic potential to rat carcinoma cells.Cell,1991,65:13～18

　　7，Woodman A C,Sugiyama M,Yoshida K,et al.Analysis of anomalous CD₄₄ gene expression in human breast.bladder and colon cancer and correlation of observed mRNA and protein isoforms.Am J Pathol,1996,149:1519～1521

　　8，Kan M,Furukawa A,Aki M,et al.Expression of CD₄₄ splice variants in bladder cancer.Int,J Urol,1995,2:295～297

　　9，Takada S,Namiki M,Matsumiya K,et al.Expression of CD₄₄ splice variants in human transitional celll carcinoma.Eur Urol,1996,29:370～372

　　10，吴忠，张元芳，刘定干，等.尿脱落细胞CD₄₄基因变异表达产物对膀胱癌诊断价值的研究.中华泌尿外科杂志，1996，9：545～547

(收稿 2000-07-10)