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N-甲基亚硝基脲诱发大白鼠膀胱肿瘤病理学动态观察

N-甲基亚硝基脲诱发大白鼠膀胱肿瘤病理学动态观察

山西医药杂志 2000年第1期第29卷 实验研究

作者:刘红耀 张旭 刘春 王东文 米振国 佟锦 李春华 李柄太 范健

单位:刘红耀(山西医科大学第一医院(030001));张旭(山西医科大学第一医院(030001));刘春(山西医科大学第一医院(030001));王东文(山西医科大学第一医院(030001));米振国(山西医科大学第一医院(030001));佟锦(山西医科大学第一医院(030001));李春华(山西医科大学);李柄太(山西医科大学);范健(山西医科大学)

关键词:化学致癌剂;N-甲基亚硝基脲;动物模型;膀胱肿瘤

  摘 要:目的 研究N-甲基亚硝基脲(MNU)诱发大白鼠膀胱肿瘤的发生、发 展过程。方法 以MNU为诱癌剂,进行大白鼠膀胱灌注,对其诱发的膀胱肿 瘤过程的不同时期进行动态观察。结果 第1次MNU灌注后第2周8/10只出现 单纯增生,第6周9/10只表现为乳头状肿瘤,第8周10/10只出现膀胱癌,主要为表浅膀胱癌 ,第10周6/10只为浸润癌。结论 MNU诱发的肿瘤发生、发展经历了从单纯 增生→乳头状、结节状良性增生→乳头状肿瘤→非浸润癌→浸润癌这样一个典型病理

  过程。

MNU-induced bladder tumor and its pathologically dynamic obser vations in rats

Liu Hongyao,Zhang Xu,Liu Chun,et al

  (The First H ospital of Shanxi Medical University,Taiyuan,030001,China)

  Abstract:Objective To study the pathologically dynamic a lterations in experimental animal model of bladder tumors induced by MNU.M ethods Bladder tumors were induced in female Wistar rats by intravesical irrigation of the carcinogen,N-methyl-nitrosourea (MNU).The morphological alte rations of bladder epithelial cells were studied by light microscopy on weeks 2, 4,6,8 and 10 after the MNU irrigation.Results Since the MNU irrigat ion 8 of the ten rats had simple hyperplasia on the second week;9 of them had be nign papilloma on the sixth week;all of them had carcinoma on the eighth week;an d 6 of them suffered from invasive carcinoma on the tenth week.Conclusion The study showed there runs a typical pathologic process induced by MNU as follows:simple hyperplasia,papillary or nodular hyperplasia,benign papilloma ,noninvasive carcinoma and invasive carcinoma.The histopathological features of animal are basically similar to those of the human.

  Key wordsCarcinogen; N-methyl-nitrosourea; Experimen tal animal model; Bladder tumor

  膀胱肿瘤是泌尿外科最常见的肿瘤,其防治研究需要建立合适 的肿瘤模型,N-甲基亚硝基脲(MNU)为直接致癌剂,自Hicks首次用来诱导膀胱肿瘤以来, 国外对此研究较多,国内研究较少,本实验就MNU诱发的大白鼠膀胱肿瘤的发生、发展过程 进行了动态观察,现报告如下。

  1 材料与方法

  1.1 试剂

  致癌剂N-甲基亚硝基脲(MNU),由美国Sigma公司生产,冷藏于-20 ℃冰箱中。

  1.2 实验动物及分组

  选用Wistar雌性大白鼠,6~7周龄,共60只,体重(160±16) g。将其随机分为两组。A组( 诱癌组)50只MNU膀胱灌注每次2 mg/只,每2周1次,共4次,MNU总量8 mg;B组(对照组)10只 不做特殊处理。

  1.3 实验方法

  1.3.1 MNU溶液的配制:在实验前一天将MNU置于4 ℃冰箱中过夜,以pH=6.0的枸橼酸缓 冲液为溶剂,配成浓度为20 g/L。

  1.3.2 MNU膀胱灌注法:用0.6%的戊巴比妥钠腹 腔注射麻醉(30 mg/kg),麻妥后用1‰ 的新洁尔灭消毒尿道外口,用消毒后的硬膜外导管导尿后,膀胱灌注。

  1.3.3 标本采集:于第1次灌注MNU后第2、4、6、8、10周各取诱癌组10只大白鼠,对照 组2只大白鼠将其处死后,立即导尿(尿液做大体肉眼及镜下观察)后注入生理盐水约2 mL, 使膀胱处于扩张状态,剖腹显露膀胱,将其完整切除,纵行切开,观察其大体变化,在病变 明显处多处取材,送光镜观察。

  1.3.4 光镜标本制备:将新鲜组织块于10%甲醛中固定24 h,常规石蜡包埋、切片4~5 μm,HE染色。

  2 结  果

  2.1 一般观察

  所有灌注MNU的大白鼠,于麻醉后2~2.5 h排尿,4~6 h恢复活动,约12 h后恢复正常。仅 A组1只导尿后,尿道外口溢血,3 d后消失。所有动物处死前,体重、活动无明显差异。

  2.2 病理观察

  2.2.1 肉眼大体观察:B组所有大白鼠膀胱壁粘膜光滑,新鲜标本为粉红色、有光泽,甲 醛固定后为白色,膀胱内无溃疡,充血、憩室及赘生物。A组50只大白鼠膀胱壁粘膜均发生 变化,且随MNU作用时间的延长、量的增多,其变化越来越明显:第2~4周膀胱内可见有点 状、片状出血,局部粘膜隆起;第6~8周膀胱壁增厚,其表面可见多发的米粒状小乳头状肿 物。第10周膀胱均见肿物,有的为占据整个膀胱腔,呈菜花状,乳头短,呈红色,局部为竭 色,有的表面溃疡,肿物活动差。

  2.2.2 光镜结果:B组所有大白鼠膀胱粘膜上皮由2~3层移行上皮细胞组成,细胞扁平大 小一致,排列有序,核圆形、浅染,粘膜细胞核浆比例1∶4~6。由内向外依次为粘膜层、 固有层、肌层和浆肌层。A组大白鼠膀胱壁粘膜均渐进性发生不同程度变化,表现为:第2周 膀胱粘膜层增厚5~7层,基底细胞活跃,可达2~3层,但全层极向分明,无异形性,细胞大 小、核浆比例基本正常。第4周镜下为膀胱粘膜增厚,乳头为圆锥形,乳头项窄底宽,细胞 排列一致,极向分明,细胞无异形性。第6周可见乳头状瘤,乳头表面被覆上皮细胞与正常 粘膜上皮结构基本相同3~5层,分化正常,排列整齐,乳头质纤细,由少量结缔组织构成, 含较多薄壁毛细血管。第8周发生癌变,表现为乳头彼此粘连,细胞数目5层以上,核排列紧 密大小不一,间质纤细,由少量结缔组织构成,核染色呈粗颗粒状堆积核膜下。第10周异形 明显,表现为细胞大小不一,排列紊乱,极向消失,核大,形态不一,核畸形,核染色质呈 粗粒状,分布不均匀,常堆积于核膜下,核膜增厚,核仁肥大,核浆比例大,可见核分裂象 ,有的表现为癌细胞高度未分化,移行上皮结构特征完全消失,呈弥漫分布或排列成实体性 癌巢,癌细胞多形性明显,大小悬殊。癌细胞侵犯粘膜固有层及肌层。除A组3只大白鼠输尿 管下端局部增厚,病理为增生,及1只大白鼠左肾积水,病理变化为肾萎缩,其余各组其他 脏器未见异常,淋巴结未见转移灶。

  3 讨  论

  早在1938年文献[1]等用己萘胺喂狗诱发了膀胱肿瘤。文献[2,3]1964年报道了在饮水 中加用N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺(BBN)40周诱发了膀胱肿瘤,1967年Erturk[1 ]报道了N-[4-(5-硝基-2-呋喃基)-2-噻唑基]甲酰胺(FANFT)诱发膀胱肿瘤,但 上述方法均需经口给予,因饮水瓶常有漏水现象,用量不易确切,不利于对照和统计处理, 且有需时长(20周)、费用昂贵等缺点,Hicks[4]首次报道了MNU经膀胱灌注诱发了 膀胱肿瘤实验模型,与BBN、FANFT相比较,MNU诱发肿瘤方法简单,用量少,诱瘤需时短。

  3.1 MNU诱发大白鼠膀胱肿瘤的病理过程

  MNU分子式CH3N(NO)CONH2,属亚硝基化合物中的亚硝酰胺类,为直接致癌剂,多数学者 认为与细胞内某些结构的烷基化有关,它能使细胞大分子,特别是核酸的鸟嘌呤分子发生烷 化作用(甲基化作用)。MNU自发分解与溶液pH值有关[5],pH=6时其半衰期为300 min,pH=7时72 min,pH=8时为6 min。本实验采用pH=6枸橼酸缓冲液为溶剂,30 min内用完。 其半衰期较Hicks[4]采用的pH=7的缓冲液相对长,确保MNU在膀胱内的作用时间, 增强了MNU的诱癌作用,本实验采用戊巴比妥钠麻醉,经尿道用硬膜外导管导尿后灌入MNU, 95%的大白鼠于麻醉后2~2.5 h方排尿,满足MNU在膀胱内保留2 h,排除了Serers等[ 5]及Hicks[4]灌入后钳夹尿道2 h可能造成的损伤。本实验采用多次灌注法,符 合Rous和Kidd提出的恶性肿瘤发生的两个阶段即启动阶段及促癌阶段理论,而这一理论对临 床及预防医学中防癌、治癌有指导意义。本实验采用MNU多次膀胱灌注法,大白鼠膀胱壁粘 膜渐进性发生不同程度变化,其肿瘤发生、发展与类肿瘤相似经历了从单纯增生→乳头状 、结节状良性增生→乳头状肿瘤→非浸润癌→浸润癌这样一个典型病理过程。在给药6~8周 的标本中可见上述各种不同阶段的病理变化同时存在,提示大白鼠膀胱肿瘤在时间与空间上 具有多病灶的特点。Irving等[6]研究表明,MNU分次灌入膀胱内其诱癌率与MNU总 量或灌入次数正相关,且诱癌需时与MNU总剂量负相关。Serers等[5]报道了少量多 次MNU灌入膀胱其肿瘤发生率较大量少次的显著增高。

  3.2 MNU诱癌的特异性及膀胱肿瘤性质比较

  本实验诱癌组结果表明,除膀胱外其他脏器未见肿瘤发生,仅3只输尿管下端局部增厚(1只 管腔狭窄致肾积水)病理检查均为增生,考虑与反流有关,与国外Hicks及Serers一致,证明 MNU膀胱灌注具有膀胱特异性。本实验诱导的膀胱肿瘤组织学形态及病理特征与膀胱肿瘤 十分相似,都来自粘膜上皮,其中移行上皮癌占80%,较类膀胱肿瘤中移行上皮癌(90%)低 ,与国外观察相同,20%为鳞癌及鳞癌与移行细胞混合,较类较高(6%~7%),考虑与MNU局 部刺激使细胞鳞状化生有关,但观察膀胱癌全切除标本发现膀胱癌中50%为混合性肿瘤。其 中移行上皮和鳞状细胞混合肿瘤为36%。本实验诱癌组未见腺瘤,类膀胱癌中腺癌最少, 仅约占1%~2%。

  总之,MNU诱发的大白鼠膀胱肿瘤病理过程可分为3个阶段,即:上皮增生期(2~3周)、乳头 状瘤形成期(6~8周)和癌变期(8~10周)。

  基金项目:青年基金课题(991024)

  作者简介:刘红耀,男,1965年5月生,主 治医师,山西医科大学第一医院,030001

  参考文献:

  [1] Erturk E,Price JH,Cohen S,et al.The production of carcinomas o f the urinary bladder in rats by feeding N-(4-5-nitro-2-furyl)-2-thiazoly formamide.Cancer Res,1967,27:1988-1998

  [2] Ito N,Hiasa Y,Tamai A,et al.Histogensis of urinary bladder tum ors induced by N-butyl-N(4-hydroxybutyl)nitrosamine in rats.GANN,1969,60:401 -410

  [3] Druckrey H.Selekture Enzengung von Blasenkrebs an Ratten durch Dibutyl and N-Butyl-N-butanol (4)-nitrosamin.Z Krebsforsch,1964,66:280

  [4] Hicks RM.Multistage carcinogenesis in the urinary bladder.Br M ed Bull,1980,36:39-46

  [5] Serers NJ,Barnes SH,Wright R,et al.Induction of bladder cancer in rats by fractionated intravesicular doses of N-methyl-N-nitrosourea.Br J Cancer,1982,45:337-350

  [6] Irving CC,Cox R,Murphy WM,et al.Influence of dose of N-nitros ourea on the induction of urinary bladder cancer in rats.Cancer letter,1979,8(1):3-7

收稿日期:1999-11-02


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