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细胞周期蛋白E对乳腺癌细胞MCF-7生长及周期相关基因的影响

细胞周期蛋白E对乳腺癌细胞MCF-7生长及周期相关基因的影响

  中华病理学杂志2000年第29卷第3期

  黄玫 杨邵敏 廖松林 张波 由江峰

  摘 要 目的 观察细胞周期蛋白(cyclin)E的表达对乳腺癌细胞MCF-7生长及其他周期相关基因的影响。方法 构建正义和反义cyclin e cDNA真核表达载体,并采用lipofect AMINE转染,将其导入MCF-7细胞,获得稳定表达正义及反义cyclin e的细胞系,经Southern和Western blot检测有外源性片段的插入及表达;并作细胞生长曲线、四甲基偶氮唑盐(MTT)法和流式细胞计数分析;用Western blot检测其他周期相关基因的表达。结果 cyclin E的高表达可以使细胞的生长速度加快(1.52倍),DNA合成增加(4.2倍),G1-S期的移行加速,pRB的磷酸化形式增多(约为对照组的3倍),但同时也上调p27的表达;而反义cyclin e则有相反的结果,降低cyclin E表达,并使细胞的生长减缓(抑制率为17.5%),DNA合成下降(48.6%), g1-S期移行减缓;同时pRB的低磷酸化形式增多,并下调p27。结论 cyclin e的表达可以影响乳腺癌MCF-7细胞的生长及增殖,并可能通过pRB的磷酸化而影响细胞周期G1-S期移行,而实现其调节功能。

  关键词:乳腺肿瘤;细胞周期蛋白质类;基因,CDC;转染;肿瘤细胞,培养的

  细胞周期蛋白E( cyclin E )是G1期重要的周期蛋白,与细胞周期蛋白质依赖激酶(cyclin dependent kinase 2,CDK2)结合促进pRB的磷酸化,并与增殖细胞核抗原(PCNA)及细胞周期蛋白质依赖激酶抑制因子(CKI)家族基因结合,促进细胞周期G1-S移行的进程,加速细胞的生长、增殖[1]。近年来发现,多种类肿瘤有cyclin e基因的扩增和过度表达;cyclin E与乳腺癌的预后密切相关[2],可协同某些癌基因转化细胞和增强细胞的癌变倾向[3]。为了直接探讨cyclin e的表达对乳腺癌细胞的生长调控及对周期其他相关基因的影响,我们将正、反义cyclin e导入乳腺癌MCF-7细胞系中,对其细胞生物学行为及细胞周期相关基因表达的影响作了观察。

  材料和方法

  1.材料:pRC-cyclin E质粒由美国哈佛医学院Arnold博士赠送,lipofectAMINE,G418购自Gibco公司,HindⅢ,T4 dNA连接酶、小牛肠碱性磷酸酶、Wizard DNA质粒提纯试剂盒、RNA体外转录Riboprobe试剂盒购自Promega公司,cyclin e单克隆抗体购自Santa Cruz公司, cyclin D1、 pRB、p27单克隆抗体购自福州迈新公司。乳腺癌细胞MCF-7由军事医学科学院陆应麟教授惠赠。

  2.MCF-7细胞cyclin E表达载体模型的建立:(1)DNA重组:质粒扩增,酶切,DNA连接,大肠杆菌转化参见文献[4]。(2)基因转染:采用Lipofect-AMINE基因转染技术,具体方法参见厂家说明。转染48 h后换含1 000 μg/ml G418的完全培养基筛选阳性克隆,G418持续加压3周。获得转化细胞系分别命名为MCF-7-cyclin e-s(正义),MCF-7-cyclin E-as(反义)和MCF-7-pcDNA3(空载体)。

  3.Southern blot检测目的基因: 提取基因组DNA 20 μg,按3 μl/μg dNA的量加入限制性内切酶HindⅢ,反应总体积为300~400 μl, 37℃温育12 h。以α-32P标记的1.5 kb cyclin E cDNA片段为探针(Promega公司DNA随机引物标记试剂盒标记)。Southern印迹及杂交方法按常规方法进行。

  4.蛋白质免疫印迹检测:培养细胞用PBS缓冲液洗2遍,用自制细胞刮子收集细胞,加入悬浮缓冲液混匀,加等体积的2×十二烷基硫磺酸钠(SDS)上样缓冲液,冰浴30 min,沸水中10 min,10 000 r/min离心 10 min,收集上清。用Lowry法测定蛋白浓度。每个泳道上样量为100μg。抗体的浓度分别为cyclin E 1∶100、 cyclin D1 1∶20、pRB 1∶100、 p27 1∶20。

  5.检测cyclin E基因转染对MCF-7细胞体外生长特性的影响[4,5]:(1)于25 ml培养瓶内接种1×105个对数生长期的细胞,每日计数3瓶细胞,连续8 d,绘制其生长曲线。(2)3H-TdR掺入:于96孔板内接种7.5×103个对数生长期的细胞,孵育箱中培养18 h时后取出,每孔加入18.5 TBq3H-TdR,继续培养6 h,收集细胞于玻璃纤维膜上,测定cpm值。(3)四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定:接种细胞数同3H-TdR掺入,孵育箱培养24 h后取出,每孔加入10 μl MTT(终浓度5 mg/ml),继续培养4 h,见针状结晶形成,加入200μl 二甲基亚砜(DMSO),测570 nm时吸光度(A,曾称光密度OD)值。观察细胞存活情况。(4)软琼脂集落形成:于6孔板内将下层1.2%低熔点琼脂糖与2×DMEM培养基、上层0.7%低熔点琼脂糖与2×DMEM以1∶1混合,内含细胞600个,CO2孵箱内培养10 d。

  6.流式细胞仪分析:取对数生长期的MCF-7细胞,按常规方法收集细胞,固定后于FACScan流式细胞仪(BecTonDICKINSON公司)上检测。

  7.统计学处理:样本均数间差异用t检验,周期分布组间差异用χ2检验。

  结果

  1.MCF-7细胞cyclin E表达模型的建立:(1)用HindⅢ将1.5 kb的cyclin E cDNA片段从质粒pRC-cyclin E上切下,克隆到pcDNA3中的HindⅢ位点,经PstⅠ及Bam HI双酶切鉴定筛选得到含正义及反义cyclin e cDNA 质粒,分别命名为pcDNA3-cyclin E-s和pcDNA3-cyclin E-as,见图1,2。(2)鉴定转染细胞克隆株:Southern blot 基因组DNA经HindⅢ酶切后,转膜后杂交,各组均可见一条5 kb左右的条带,而转染正义及反义组另见一1.5 kb的条带,为外源性插入片段,证明外源基因已整合于细胞染色体中,见图3。Western blot分析转染后cyclin E表达水平,得到cyclin E高、低表达的克隆各1个,见图4。

图1 重组质粒图

1:λDNA HindⅢ标记物,2:cyclin E质粒,3:正义PstⅠ酶切,4:正义Bam HI酶切,5:反义Bam HI酶切,6:反义PstⅠ酶切,7:cyclin e质粒,8:λDNA HindⅢ标记物图2 重组质粒鉴定电泳结果

  2. cyclin E基因转染对MCF-7细胞体外生长特性的影响:生长速度测定表明,MCF-7-cyclin e-s细胞较对照组MCF-7-pcDNA3快,约为对照组的1.52倍。同样3H-TdR掺入率明显增高,是对照组细胞的4.2倍。MTT测定显示,MCF-7-cyclin e-s细胞的增殖及代谢能力是对照细胞的1.43倍,经检验P<0.05。而MCF-7-cyclin e-as细胞的生长较对照组明显减慢,生长抑制率达17.5%;3H-TdR掺入率降低,仅为对照的48.1%。MTT显示其生长抑制率为18.4%,P均<0.05,结果见图5,表1。说明cyclin e的高表达促进细胞生长及DNA合成,而反义cyclin E则降低细胞增殖,抑制DNA复制。软琼脂集落形成实验中,MCF-7-cyclin e-as所形成的集落较MCF-7-cyclin E-s少,而较MCF-7-pcDNA3多,但经统计学检验差别无显著性意义(表1)。

1:空载体,2:正义,3:反义图3 转染细胞Southern杂交结果

1:空载体,2:正义,3:反义图4 Western blot检测cyclin E结果

表1 3H-TdR掺入值,MTTA值,周期分布及软琼脂集落形成情况

细胞 3 H-TdR

  掺入值

MTTA值 周期分布(%) 软琼脂集落

  形成率

(cpm,%,

±s)

(±s) G1 S G2+

  M

(%,±s)
MCF-7-

  pcDNA3

2 013±

  247

0.174±

  0.001

63.3 31.5 5.1 205.3±

  20.4

MCF-7-

  cyclin

  E-s

8 526±

  485*

0.248±

  0.009*

55.4 38.3 6.3 271.6±

  17.0

MCF-7-

  cyclin

  E-as

969±

  27*

0.142±

  0.002*

69.5 21.8 8.7 243.7±

  11.0

  注:3个细胞系,重复2次,每次3个孔,共6次,*P<0.05,P>0.05

图5 MCF-7细胞生长曲线

  3.细胞周期的改变(表1):(1)分析表明,停滞于G1期的MCF-7-cyclin e-as细胞(69.5%)较MCF-7-pcDNA3(63.3%)多,而MCF-7-cyclin E-s细胞(55.4%)则较MCF-7-pcDNA3细胞(63.3%)少,S期细胞相应增多。说明 cyclin E的高表达促进G1到S期的移行,而低表达则抑制这种过渡,但差异无显著性(χ2=7.059,P>0.05)。(2)Cyclin e基因表达对 pRB, p27, cyclin D1蛋白水平的影响:如图6所示,对照组有pRB的表达,当转入cyclin e后,pRB的表达状态及量均受cyclin E表达水平的影响。具体表现为cyclin e表达增高时pRB高磷酸化(ppRB)的状态明显增多(即泳动较慢的条带),大约是对照组的3倍;而cyclin e表达状态降低时失活状态的非磷酸化的状态增多,而高磷酸化状态略有减少。p27的表达则随着cyclin e的增高或降低而升高或降低(图7)。cyclin D1的表达未见明显的改变,(图8)。

图6 Western blot检测

  pRB的表达结果

图7 Western blot检测p27的表达结果

图8 cyclin D1的Western blot检测结果

  讨论

  在多种肿瘤中cyclin E有基因扩增及过表达,与乳腺癌的预后关系密切[2];并与ras共同使鼠纤维母细胞发生恶性转化[3];转基因鼠可以引起细胞的异常增殖及乳腺癌的发生[6];cyclin E高表达可加速G1期进程[7],并可逆转p27引起的G1期阻滞[8]。这些都表明cyclin E可以促进细胞的生长,增殖,并可能通过调节G1期和S期的移行而发挥作用。在本研究中,导入正义cyclin E后MCF-7细胞生长速度、DNA合成及细胞增殖和代谢的能力均明显上升。与此相对应的是G1期细胞数目减少,S期细胞增加。导入反义cyclin E后细胞生长速度、DNA合成及细胞增殖和代谢的能力均下降,G1期细胞数目增多,S期细胞减少。这一结果与以往研究一致,表明cyclin e的高表达促进细胞的生长,而降低cyclin E可以部分延缓细胞的增殖。但是在软琼脂集落形成实验中,cyclin E的表达未能显著影响细胞的停泊依赖性生长,这也可解释cyclin E尚不能使细胞获得完全性自主生长[3]

  周期蛋白E是G1期重要的周期蛋白,它与CDK2形成复合物,促进pRB磷酸化[9]。实验也同样显示 cyclin E的高表达使pRB磷酸化的形式明显增多,大约是对照组的3倍;而cyclin E的低表达则使pRB的低磷酸化形式增多。说明cyclinE通过对pRB的磷酸化作用影响细胞的生长及周期的进程。

  p27为周期蛋白/CDKs复合物的抑制剂,因而抑制细胞周期的演进。但本研究显示cyclin E与p27的表达有一致性,这与cyclin D1与p27的表达的相关性相似:在8个食管癌细胞系中cyclin D1与p27的表达有明显的正相关,并且cyclin D1的转染可增强p27的表达[10]。Pagano m等[11]认为,可能在部分细胞中pRB、cyclin D1和p27之间存在一个稳态正反馈调节通路,并可能与泛素-蛋白酶路径参与p27蛋白的降解有关。

  有研究显示cyclin D1可促进cyclin E基因的表达,因其激活子上存在一个与E2F结合的位点[12],当高表达cyclin d1时促进pRB的失活,解离出的E2F与cyclin E的启动子结合,因而活化cyclin e基因。在本实验中,cyclin E基因转染对cyclin D1未见明显影响。可能两者的作用是单向的,或与实验用细胞系有关。

  我们通过基因转染直接观察了cyclin E基因表达对癌生物学特性的影响,表明上调cyclin E可以通过对pRB的磷酸化的调节而影响细胞周期的进程,从而调节细胞的生长和增殖;并可同时影响p27基因状态。这对于阐明cyclin E基因表达与乳腺癌细胞生物学特性的关系有一定的帮助。

  作者单位:黄玫(100083 北京医科大学病理学系)

  杨邵敏(100083 北京医科大学病理学系)

  通信作者:杨邵敏、廖松林

  参考文献

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  2 Keyomarsi K, O'leary N, Molnar G, et al. Cyclin E, a potential prognostic marker for breast cancer. Cancer Res, 1994,54:380-385.

  3 Haas K, Johannes C, Geisen C, et al. Malignant transformation by cyclin E and Ha-Ras correlates with lower sensitivity towards induction of cell death but requires functional Myc and CDK4. Oncogene, 1997,20,15:2615-2623.

  4 鄂征. 培养细胞生物学性状检测.见:鄂征主编,组织培养和分子细胞学技术.北京:北京出版社,1995. 151-161.

  5 韩复生,张霆钧. 抗癌药物耐药性的检测.见:鄂征主编,组织培养和分子细胞学技术.北京:北京出版社,1995.434-449.

  6 Bortner DM, Rosenberg MP. Induction of mammary gland hyperplasia and carcinomas in transgenic mice expressing human cyclin E. Mol Cell Biol,1997,17:453-459.

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  11 Pagano M, Tam SW, Theodoras AM, et al. Role of the ubiquitin-proteasome pathway in regulating abundance of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27. science, 1995,269:682-685.

  12 Ohtani K, DeGregori J, Nevins JR. Regulation of the cyclin E gene by transcription factor E2F. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995,92:12146-12150.


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