血管生成与DMBA诱发的大鼠乳腺癌转移的关系

中国肿瘤临床 2000年第4期第27卷 实验肿瘤

作者：蒋晓山　黄信孚　李吉友　何洛文　刘美生

单位：蒋晓山　北京医科大学临床肿瘤学院北京市肿瘤研究所（北京市　100034）；黄信孚　北京医科大学临床肿瘤学院北京市肿瘤研究所（北京市　100034）；李吉友　北京医科大学临床肿瘤学院北京市肿瘤研究所（北京市　100034）；何洛文　北京医科大学临床肿瘤学院北京市肿瘤研究所（北京市　100034）；刘美生　北京医科大学临床肿瘤学院北京市肿瘤研究所（北京市　100034）

关键词：血管生成；转移；乳腺癌

　　摘要目的：探讨肿瘤血管生成与乳腺癌转移的关系。方法：采用二甲基苯蒽（DMBA）诱发的大鼠乳腺癌模型，以免疫组织化学染色方法检测肿瘤组织微血管密度（MVD）及血管内皮生长因子（VEGF）表达。结果：转移组原发瘤灶MVD及瘤细胞VEGF表达显著高于非转移组（分别P＜0.001和 P＜ 0.02）及良性肿瘤组（两者均P＜ 0.001）。结论：VEGF介导的血管生成在促进乳腺癌转移的过程中可能起重要作用。

　　A Study on the Correlation between Angiogenesis and Metastasis

　　in DMBA－induced Breast Tumor Rat Model

Jiang Xiaoshan Huang Xinfu Li Jiyou et al

　　(School of Oncology, Beijing Medical University, Beijing Institute for Cancer Research, Beijing)

　　AbstractObjective: To study the correlation between angiogenesis and metastasis in breast cancer.Methods: The intratumoral microvessel density (MVD) and expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) were evaluated by immunohistochemical staining in 7,12－dimethylbenz (α) anthracene－induced breast tumors.Results: It is found that the tumors in metastatic group showed significantly higher MVD and VEGF expression than those in Non－metastatic group (P＜0.001 and P＜ 0.02 respectively) as well as benign tumor group (both P＜ 0.001), and there was clear linear correlation between MVD and VEGF expression (r="0.747" 6, P＜ 0.001).Conclusion: VEGF－mediated angiogenesis may play an important role in tumor progression and metastasis in breast cancer.

　　Key Words Angiogenesis Metastasis Breast cancer

　　肿瘤的新生血管与肿瘤生物学行为特点密切相关。我们在DMBA诱发的大鼠乳腺癌模型中，采用免疫组织化学方法检测肿瘤组织中微血管密度（MVD）及血管内皮生长因子（VEGF）表达，对肿瘤血管生成与乳腺癌转移的关系进行了研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 大鼠模型的建立

　　Sprague－Dawley雌鼠40只，鼠龄50±1天。将二甲基苯蒽（DMBA）溶于芝麻油（20mg/ml），灌喂实验鼠1ml/次/只。30天后重复同一量灌喂一次。40只鼠中成瘤率96.9％(32/33)，非荷瘤死亡7只，最长观察时间为329天。1只鼠经病理检查证实有淋巴结转移，4只有肺转移灶，此5只共有原发性乳腺癌瘤15个；另27只鼠无转移证据，共有乳腺癌瘤93个，良性瘤17个。

　　1.2 标本来源、制备及分组

　　鼠断椎处死，取瘤，自然病死鼠在2小时内取瘤。中性缓冲福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋制片，厚4μm。5只发生肺或淋巴结转移鼠共15个原发乳腺癌灶标本为转移（M^＋）组；自另27只无转移证据鼠共93个乳腺癌灶标本中随机抽取15个作为非转移（M^－）组；自17个乳腺良性肿瘤标本中随机抽取10个作为良性肿瘤（BT）组。

　　1.3 免疫组化染色

　　采用标准链霉菌卵白素生物素(S－P)法，一抗分别为兔抗人第八因子相关抗原（F8－RA）抗体（Zymed公司）和兔抗人VEGF抗体（北京市肿瘤所生化室赠）。以PBS(0.01mol/L,pH7.4)替代一抗作为染色阴性对照。

　　1.4　结果评判标准

　　1.4.1血管计数　任何被F8－RA染成棕黄或棕褐色的分界清楚的内皮细胞簇团，均作为一个微血管计数。光镜下先以放大40或100倍视野选择3个微血管最丰富区，然后在200倍视野（物镜20×,目镜10×；0.74mm²/视野）下计数各区野内微血管数，取最高值。

　　1.4.2 VEGF计数与分级　胞浆含有棕黄或棕褐色颗粒的瘤细胞被计为阳性细胞，每张切片选择3个区分别在400倍视野下连续计数200个瘤细胞。分3级，Ⅰ级：阳性细胞数占0～20％；Ⅱ级：21％～50％；Ⅲ级：＞50％。

　　2 结果

　　肿瘤组织中微血管的分布呈明显异质性。微血管丰富区多位于肿瘤组织近边缘部分，VEGF表达在肿瘤细胞胞浆。大鼠乳腺肿瘤组织MVD及VEGF表达见图1，2。

图1　大鼠乳腺肿瘤组织MVD分布盒式图

图2　大鼠乳腺肿瘤组织VEGF表达盒式

　　采用两样本等级和检验（Wilcoxon法）分析，发现MVD在M＋组显著高于M－组（P＜0.001）及BT组（P＜0.001），而M－组与BT组之间无明显差异（P＞0.05）。VEGF阳性细胞表达在M＋组显著高于M－组（P＜0.02）及BT组（P＜0.001），M－组也比BT组多（P＜0.05）（图2）。VEGF计数与MVD之间呈显著线性相关（r=0.7476,P＜ 0.000 1）。

　　3 讨论

　　肿瘤血管生成是一个包括肿瘤细胞分泌或诱导产生或激活血管生成因子、基质蛋白溶解酶激活、以及内皮细胞增殖、迁移和分化等多步骤参与的复杂过程，不仅为增殖的肿瘤细胞提供生长所需的氧及营养物质，还是侵袭的肿瘤细胞扩散转移的窗口^[1]。Weidner等^[2]首先在手术标本中证实人乳腺癌组织MVD与淋巴结转移密切相关。我们在DMBA诱发的大鼠乳腺癌模型中所获结果表明，M⁺组原发瘤组织MVD显著高于M^-组，支持Weidner及其他一些临床回顾性研究报告^[2,3]。

　　现已证实十多个具有血管生成刺激活性的“肿瘤血管生成因子”中，VEGF似乎在实体瘤、尤其是在乳腺癌的血管生成过程中具有特别意义。VEGF是一分泌型的与肝素结合的二聚体蛋白，既是促进内皮细胞生长的特异性有丝分裂原，还具有增加血管通透性的效应^[4]。本实验发现，在DMBA诱发的大鼠乳腺肿瘤模型中，M⁺组瘤细胞VEGF表达显著高于M^-组和BT组，说明VEGF表达与本组乳腺癌转移有相关性。结果还显示M^-组VEGF的表达比BT组明显增高，而这种差异在检测MVD时并不明显，提示VEGF可能是某些恶性肿瘤细胞自身的一个生物学标志，能在较早阶段介入恶性肿瘤的生长过程。此外，同一肿瘤组织中VEGF表达与MVD两者密切相关，似可佐证VEGF对肿瘤血管生成起正性调节的观点。

　　本研究结果表明，VEGF介导的血管生成可能在促进原发性乳腺癌的转移过程中起重要作用。

　　参考文献

　　［1］Folkman J. What is the evidence that tumors are angiogenesis－dependent? J Natl Cancer Inst,1991;82:4

　　［2］Weidner N,Semple JP,Welch WR,et al. Tumor angiogenesis and metastasis－correltion in invasive breast carcinoma. N Eng1 J Med,1994;324:1

　　［3］Gasparini G,Harris AL. Clinical importance of the determination of tumor angiogenesis in breast carcinoma:much more than a new prognostic tool. J Clin Oncol,1995;13:765

　　［4］Ferrara N. The role of vascular endothelial growth factor in pathological angiogensis. Breast Cancer Res Treat,1995;36:127

(1999－10－23收稿)