组织蛋白酶D表达与乳腺癌的关系
肿瘤 1999年第2期第19卷 论著
作者：袁建达 邵志敏 韩企夏 沈镇宙
单位：上海医科大学肿瘤医院外科分子生物学实验室(上海 200032)
关键词：乳腺肿瘤；组织蛋白酶D；侵袭；肿瘤转移；预后
目的 研究组织蛋白酶D(Cath-D)对乳腺癌侵袭、转移和预后的作用。 方法 采用免疫组织化学亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法，检测105例乳腺癌石蜡切片中肿瘤细胞(实质)和间质细胞组织蛋白酶D的表达，结合临床和病理资料分析其作用。 结果 组织蛋白酶D主要定位于细胞浆，部分增生的细胞可见定位于细胞核，间质细胞与实质细胞的Cath-D的定位基本相似。间质细胞以肿瘤周围的间质细胞组织蛋白酶D的表达量为高。Cath-D在乳腺癌实质和间质中总的表达率分别为49.5%(52/105)，56.2%(59/105)。实质Cath-D的表达与肿瘤细胞组织浸润、肿瘤大小、腋淋巴结转移、随访结果有关(P＜0.05)；与乳腺癌组织学分类、组织学分型、分级、年龄、ER、PR状态、局部复发、远处转移无关。间质Cath-D的表达与乳腺癌肿瘤大小、腋淋巴结转移、局部复发、远处转移、年龄、ER、PR状态、局部复发无关。实质与间质Cath-D的表达和乳腺癌患者的无瘤生存率有关(P＜0.05)；实质Cath-D表达与总生存率无关(P＞0.05)，而间质的Cath-D与总生存率有关(P＜0.05)。 结论 实质和间质乳腺癌组织蛋白酶D的表达都和侵袭、转移和预后有关。实质Cath-D反映肿瘤细胞的侵袭能力，而间质的Cath-D与远处转移和预后有关。间质Cath-D与实质Cath-D密切相关，相对而言，间质的Cath-D更能代表乳腺癌细胞的侵袭和转移的能力。组织蛋白酶D可作为一个与乳腺癌预后密切相关的预后指标。
CATHEPSIN D AND PROGNOSIS IN BREAST CANCER
Yuan Jianda,Shao Zhiming,Han Qixia,et al.Department of Surgery,Cancer Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai 200032
Objective：To study the effect of Cathepsin D(Cath-D) on breast cancer invasion, metastasis and prognosis.Methods：By means of ABC test, 105 breast cancer specimens in paraffin sections were examined for the expression of Cath-D.Results：Cath-D protein was detected in cancer cell cytoplasm;the expression rates in cancer cells and in stromal cells were 49.5% (52/105) and 56.2%(59/105) respectively.Expression of Cath-D in cancer cells was correlated to its invasiveness,bigger tumor size,higher axillary lymph node involvement and poorer prognosis(P＜0.05)，but not with those pathologic typing,grading,age,ER and PR status,local recurrence and distant metastasis.Expression of Cath-D in stromal cells was associated with bigger tumor size,axillary lymph node metastasis,regional recurrence,distant metastasis and poorer prognosis(P＜0.05).Conclusion：The neoplastic and stromal cathepsin D are neglected immunohistochemical prognostic parameters.They play a pivotal role in the invasion and breast cancer metastasis.It shows that cathepsin D,specially stromal catepsin D,induces breast cancer metastasis and influences the prognosis of patients.
Key words Breast tumor Cathepsin D Invasion Neoplasm metastasis Prognosis
乳腺癌的远处转移是导致乳腺癌临床治疗失败的主要原因。乳腺癌的远处转移是一个复杂的多步骤的过程，涉及肿瘤细胞运动、基质膜降解、肿瘤细胞与宿主细胞的粘附、转移灶新生血管的形成等。组织蛋白酶D(Cath-D)作为一个基质膜降解酶在肿瘤的转移中起重要作用。晚近，许多研究表明Cath-D与肺癌、肠癌、肝癌的转移有关［2～5］。本研究应用免疫组织化学方法检测肿瘤细胞(实质)与间质细胞中Cath-D的表达，探讨实质与间质的Cath-D在乳腺癌侵袭、转移中的作用，了解其临床意义。
材料和方法
一、材料
上海医科大学肿瘤医院1988～1989年手术切除的乳腺癌标本105例，术前未曾接受放疗和化疗。随访时间在2～9年，中位随访期5.1年，均为女性病例，年龄为25～78岁，平均年龄52.84岁。
每个病例均具有完整的临床病史资料，病理诊断和随访资料。参照《中国常见恶性肿瘤诊治规范第八分册乳腺癌》的标准，进行病理诊断，观察组织学分型、组织学分类、组织学分级和组织浸润等指标。组织学分级按Scarff-Bloom-Richardson法分为：1.组织分化程度(以腺管的形成为主要依据)，高分化为1分，中分化为2分，低分化为3分；2.核多形性：按轻、中、重分别定为1、2、3分；3.核分裂相：1～10个/10个高倍视野(HPF)为1分，11～20个/10个HPF为2分，＞21个/10个HPF为3分。将以上三方面得分相加，确定病理分级：1级(3～5分)为分化好，Ⅱ级(6～7分)为分化中，及Ⅲ级(8～9分)为分化差。病理分类：特殊型和非特殊型。组织浸润分：肿瘤边界清楚为Ⅰ级，癌瘤周边界部分清楚为Ⅱ级，癌瘤周边与周围组织分界不清楚，呈浸润性生长为Ⅲ级。无腋淋巴结转移为(-)组，1～3个腋淋巴结转移为(+)组，大于3个为()组。随访结果分：健在、带癌和死亡。所有死亡病例均死于乳腺癌。
二、方法
1、试剂
组织蛋白酶D CH18-0109多克隆抗体购于上海中达公司，ABC试剂盒Vector产品。
2、免疫组织化学染色
应用Hsu等［1］免疫组化方法染色，石蜡切片制成5 μm，依次二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，0.05%胰酶消化，37 ℃ 20 min，0.03% H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温10 min，5% 小牛血清温育，室温20 min，加入一抗50 μl，4 ℃冰箱过夜，PBS洗3次，加入生物素化马抗鼠IgG 50 μl，4℃冰箱过夜，PBS洗3次，加入生物素化马抗鼠IgG 50 μl，37℃ 1 h，PBS洗3次，加入SABC试剂50 μl，37 ℃30 min，PBS洗3次，0.04% DAB-0.03% H2O2室温显微镜下控制显色5 min。由于组织蛋白酶D部分定位于细胞核，故未用苏木素复染，清水洗涤后常规脱水、透明，封片。
3、阳性染色反应分级判断标准
以细胞浆或细胞核出现棕色颗粒为阳性细胞。根据细胞浆阳性综色颗粒的着色深浅，将染色强度分为(Ⅰ)无反应或微弱反应；(Ⅱ)棕色反应；(Ⅲ)深棕色反应三组，计算(Ⅱ)、(Ⅲ)两组每例切片5个高倍视野中阳性染色反应细胞的百分率，并将(Ⅰ)组病例数归入染色反应(-)组，最后确定组织蛋白酶D染色反应半定量分级：(-)为0～25%，(+)为26～74%，(++)为75～100%。实验中去一抗作为阴性对照，同时应用MCF-7人乳腺癌细胞爬片染色作为阳性对照。
三、统计学分析
采用上海医科大学流行病学教研室Epi Info(5.0板本)统计软件进行χ2检验，比较组织蛋白酶D表达水平与乳腺癌临床及病理指标的关系。应用Kaplan Meier寿命表法计算总生存率和无瘤生存率。P＜0.05认为具有统计学意义。
结 果
一、组织蛋白酶D的定位及表达水平
免疫组化染色的结果，105例乳腺癌实质与间质细胞组织蛋白酶D均定位于细胞浆、部分定位于细胞核，其染色强度和阳性细胞百分率明显不同，呈异质性分布。癌旁乳腺良性病变组织蛋白酶D的定位和乳腺癌细胞相似(见插页第3页图1)。
1 实质与间质Cath-D在乳腺癌细胞浆上阳性表达（SABC法×400）,
中央区为阳性肿瘤细胞,肿瘤周边间质细胞阳性表达
表1 实质和间质Cath-D蛋白表达水平与病理指标的关系
| 临床病理指标 |
例数 |
实质Cath-D表达 |
阳性率
(%) |
χ2值 |
P |
间质Cath-D表达 |
阳性率
(%) |
χ2值 |
P |
| - |
+ |
++ |
- |
+ |
++ |
| 组织学分类 |
|
| 髓样癌 |
12 |
7 |
1 |
4 |
41.7% |
|
6 |
4 |
2 |
50% |
|
| 腺癌 |
5 |
5 |
0 |
0 |
0% |
|
3 |
1 |
1 |
40% |
|
| 单纯癌 |
32 |
14 |
9 |
9 |
57.6% |
|
12 |
12 |
8 |
62.5% |
|
| Pagets病 |
3 |
3 |
0 |
0 |
0% |
18.08 |
0.2083 |
3 |
0 |
0 |
0% |
16.80 |
0.5334 |
| 浸润性导管癌 |
42 |
20 |
8 |
14 |
52.4% |
(v=14) |
|
20 |
10 |
12 |
52.4% |
(v=14) |
|
| 小叶癌 |
4 |
2 |
2 |
0 |
50% |
|
1 |
3 |
0 |
75% |
|
| 浸润性小叶癌 |
2 |
0 |
1 |
1 |
100% |
|
0 |
1 |
1 |
100% |
|
| 其它类型 |
5 |
2 |
2 |
1 |
60% |
|
2 |
3 |
0 |
60% |
|
| 组织学分型 |
|
| 特殊型 |
92 |
45 |
20 |
27 |
51.1% |
1.17 |
0.5562 |
38 |
31 |
23 |
58.7% |
3.87 |
0.1441 |
| 非特殊型 |
13 |
8 |
3 |
2 |
38.5% |
(v=2) |
|
9 |
3 |
1 |
30.8% |
(v=2) |
|
| 组织学分级 |
|
| Ⅰ级 |
62 |
33 |
15 |
14 |
46.8% |
|
32 |
19 |
11 |
48.4% |
|
| Ⅱ级 |
34 |
19 |
4 |
11 |
44.1% |
8.65 |
0.0703 |
12 |
11 |
11 |
64.7% |
4.11 |
0.3915 |
| Ⅲ级 |
9 |
1 |
4 |
4 |
88.9% |
(v=4) |
|
3 |
4 |
2 |
66.7% |
(v=4) |
|
| 组织浸润 |
|
| Ⅰ级 |
43 |
28 |
9 |
6 |
34.9% |
|
26 |
12 |
5 |
39.5% |
|
| Ⅱ级 |
40 |
20 |
8 |
12 |
50% |
15.08 |
0.0196 |
15 |
13 |
12 |
62.5% |
11.38 |
|
| Ⅲ级 |
21 |
4 |
6 |
11 |
81.0% |
(v=6) |
|
5 |
9 |
7 |
76.2% |
(v=6) |
0.047 |
| Ⅳ级 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0% |
|
1 |
0 |
0 |
0% |
|
表2 实质和间质Cath-D蛋白的表达水平与临床指标的关系
| 临床病理指标 |
例数 |
实质Cath-D表达 |
阳性率
(%) |
χ2值 |
P |
间质Cath-D表达 |
阳性率
(%) |
χ2值 |
P |
| - |
+ |
++ |
- |
+ |
++ |
| 年龄 |
|
| ≤40 |
20 |
10 |
3 |
7 |
50% |
|
5 |
8 |
7 |
75% |
|
| 40～60 |
53 |
26 |
12 |
15 |
50.9% |
1.44 |
0.8371 |
28 |
15 |
10 |
47.2% |
4.87 |
0.3013 |
| ＞60 |
32 |
17 |
8 |
7 |
46.9% |
(v=4) |
|
14 |
11 |
7 |
56.3% |
(v=4) |
|
| 肿瘤大小 |
|
| ＜3 cm |
56 |
34 |
13 |
9 |
39.3% |
8.38 |
0.0151 |
31 |
13 |
12 |
44.6% |
6.85 |
0.0325 |
| ≥3 cm |
49 |
19 |
10 |
20 |
61.2% |
(v=2) |
|
15 |
15 |
19 |
57.6% |
(v=2) |
|
| 腋淋巴结转移 |
|
| - |
48 |
36 |
8 |
4 |
25% |
|
31 |
12 |
5 |
35.4% |
|
| + |
28 |
11 |
9 |
8 |
60.7% |
30.04 |
0.004 |
9 |
14 |
5 |
67.9% |
23.42 |
0.0001 |
| ++ |
29 |
6 |
6 |
17 |
79.3% |
(v=4) |
|
7 |
8 |
14 |
75.9% |
(v=4) |
|
| ER状态 |
|
| - |
54 |
28 |
11 |
15 |
48.2% |
0.16 |
0.9221 |
23 |
19 |
12 |
57.4% |
0.41 |
0.8160 |
| + |
51 |
25 |
12 |
14 |
51.0% |
(v=2) |
|
24 |
15 |
12 |
52.9% |
(v=2) |
|
| PR状态 |
|
| - |
72 |
35 |
19 |
18 |
52.1% |
2.83 |
0.2430 |
33 |
23 |
16 |
54.2% |
0.11 |
0.9452 |
| + |
33 |
18 |
4 |
11 |
45.5% |
(v=2) |
|
14 |
11 |
8 |
49.4% |
(v=2) |
|
| 局部复发 |
|
| 无 |
94 |
50 |
20 |
24 |
46.8% |
2.89 |
0.2360 |
42 |
32 |
20 |
55.3% |
1.75 |
0.4174 |
| 有 |
11 |
3 |
3 |
5 |
72.7% |
(v=2) |
|
5 |
2 |
4 |
54.5% |
(v=2) |
|
| 远处转移 |
|
| 无 |
77 |
42 |
18 |
17 |
45.4% |
4.44 |
0.1085 |
38 |
26 |
13 |
50.6% |
6.04 |
0.0488 |
| 有 |
28 |
11 |
5 |
12 |
60.7% |
(v=2) |
|
9 |
8 |
11 |
67.9% |
(v=2) |
|
| 随访结果 |
|
| 健在 |
81 |
46 |
18 |
17 |
43.2% |
|
42 |
26 |
13 |
48.1% |
|
| 带癌 |
14 |
5 |
2 |
7 |
64.3% |
9.40 |
0.0518 |
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