直接原位逆转录-聚合酶链反应检测慢性粒细胞白血病bcr/abl mRNA

中华血液学杂志 2000年第7期第21卷 方法介绍

作者：李中秋　陈泊　李全贞

单位：李中秋（421001　衡阳市，解放军第169医院一内科）；陈泊（第一军医大学生化教研室）；李全贞（珠江医院血液科）

　　逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测慢性粒细胞白血病(慢粒)bcr/abl mRNA已应用于临床诊断和微小残留病的检测，但该方法不能反映bcr/abl mRNA和细胞结构之间的关系，且RNA提取操作要求较高，应用受到一定的限制。我们拟建立直接原位RT-PCR检测慢粒bcr/abl mRNA的方法。

　　材料和方法

　　1　细胞　抽取经临床确诊的慢粒患者外周静脉血，Ficoll分离出外周血单个核细胞。

　　2　细胞涂片及固定　取2×10⁶／ml单个核细胞悬液50μl，离心涂片于包被0.2g/L多聚赖氨酸的载片上，用体积分数为4％的多聚甲醛固定20min。

　　3　细胞预处理　10μg／ml蛋白酶K 37℃消化5min。

　　4　引物　引物设计参照文献［1,2］，bcr引物1:5′-CTCCAGACTGTCCACAGCATTCCG-3′,abl反义引物2:5′-CAGACCCTGAGGCTCAAAGTCAGA-3′，由中山医科大学达安基因诊断中心合成。

　　5　原位PCR　玻片置于多载片PCR仪，加逆转录反应液75μl，含RNasin　50U，AMV逆转录酶20U，dNTP 200μmol／L，MgCl₂ 60mmol／L，abl反义引物2 20pmol／L,40℃反应40min。每一载片加PCR反应液100μl，含Taq酶2U,MgCl₂ 1.5mmol／L,dNTP 200μmol／L及地高辛-dUTP 10μmol／L，bcr引物1和abl反义引物2 20pmol／L。预变性5min，94℃　60s，55℃ 60s，72℃ 60s，共10个循环，后72℃延伸5min。

　　6　洗脱　45℃ 0.1×SSC洗2次,每次20min。

　　7　地高辛检测及显色　使用地高辛检测试剂盒检测扩增产物。1∶500抗地高辛抗体孵育细胞2h，缓冲液彻底冲洗后加上反应物液NBT和BCIP，显微镜下观察结果。显微镜摄影。

　　8　对照的设置　K562细胞为阳性对照；阴性对照包括HL-60细胞，除省略逆转录酶或省略扩增引物外，其它条件与检测样本一致。

　　结果

　　1　结果判定　细胞胞浆中出现紫褐色为阳性结果；无紫褐色为阴性结果。阳性结果表示胞浆存在bcr/abl mRNA逆转录扩增产物。

　　2　检测结果　K562细胞表达阳性；被检样本表达阳性；阴性对照表达阴性或弱阳性(背景污染等所致)。

　　3　灵敏度　本方法能检测单个细胞内的RNA，灵敏度达到10^-6。

　　讨论

　　直接原位RT-PCR是原位PCR的一种改良方案，这种方案更直接且容易实施，但由于引物错配和非特异性退火发生，容易产生非特异性结果^［3］。Martinez等^［4］认为，使用正确的对照能消除这个问题。本实验中我们采用直接原位RT-PCR检测bcr／abl　mRNA，阳性对照及被检样本表达阳性，阴性对照表达阴性，肯定了该方法的特异性。我们采取了如下措施避免非特异性结果：①采取了物理热启动法PCR，减少了引物错配和引物二聚体形成的可能；②摸索出最适PCR循环数；③设立了严格的阴、阳性对照。

　　直接原位RT-PCR与传统RT-PCR相比，在技术操作和应用范围有如下优点：①传统RT-PCR不能反映扩增产物和组织结构之间的关系，直接原位RT-PCR能够在组织切片或完整细胞中检测单个拷贝的RNA，同时还可鉴定细胞结构；②直接原位RT-PCR避免了提取mRNA程序。

　　直接原位RT-PCR检测慢粒bcr／abl mRNA具有敏感性高,特异性好,无须提取RNA等优点，可应用于慢粒微小残留病的检测和基础研究。

参 考 文 献

　　1，Delage R,Soiffer RJ,Dear K，et al. Clinical significance of bcr/abl gene rearrangement detected by polymerase chain reaction after allogeneic bone marrow transplantation in chronic myelogenous leukemia. Blood,1991,78:2759-2767.

　　2，Dobrovic A,Trainor KJ,Morley AA.Detection of the molecular abnormality in chronic myeloid leukemia by use of the polymerase chain reaction. Blood,1988,72:2063-2065.

　　3，Komminoth P,Long AA.In situ polymerase chain reaction:an overview of methods, applications and limitations of a new molecular technique. Virchows Arch,1993,64:67-72.

　　4，Martinez A, Miller MJ, Quinn K, et al. Non-radioactive localization of nuleic acids by direct in situ PCR and in situ RT-PCR in paraffin-embedded sections. J Histochem Cytochem, 1995,43:739-747.

(收稿日期：1999-05-17)