白血病端粒酶检测与临床观察

临床血液学杂志 2000年第2期第13卷 临床研究

作者：李昕权　王丹红　郭梅　姚波

单位：李昕权(军事医学科学院附属医院血液科　北京，100039)；王丹红(军事医学科学院附属医院血液科　北京，100039)；郭梅(军事医学科学院附属医院血液科　北京，100039)；姚波(军事医学科学院附属医院血液科　北京，100039)

关键词：端粒酶；白血病；染色体

　　摘　要：目的：检测急性白血病端粒酶与临床的关系。方法：端粒重复扩增法结合吸光度测定及临床病例分析。结果：各种类型急性白血病均表现高的端粒酶活性，伴有异常染色体核型或高细胞白血病病例具有明显高的活性。结论：急性白血病端粒酶活性与异常染色体核型和病情相关，检测白血病细胞端粒酶，有助于白血病的诊断治疗。

Test of Telomerase Activity of Acute Leukemia and Clinical Observation

LI Xin-quan　WANG Dan-hong　GUO Mei　YAO Bo

　　(Department of Hematology,Affiliated Hospital,Academy of Military Medical Sciences,Beijing,100039)

　　Abstract：Objective:Test of telomerase activity of acute leukemia and exploringits clinical significance.Methods:The telomeric repeat amplification protocol(TRAP)combined with densitometry and clinical examination were performed in leukemia patients.Results:The strong telomerase activity was observed in presence of acute lymphoblastic leukemia and myeloid leukemia.The telomerase activity of the patients with abnormal chromosomes was higher than that of the cases with normal karyotype.The patients with high leucocyte count showed high telomerase activity.Conclusion:The acute leukemia has high telomerase activity,which is related to abnormal karyotyp and clinical findings.The analysis of telomerase acticity might be significant in diagnosis and treatment of leukemia.

　　Key words：Leukemia　Telomerase　Chromosome▲

　　端粒是真核细胞染色体末端由(TTAGGG)n重复序列组成的结构，具有维持染色体稳定的重要作用，端粒长短变化和稳定与细胞的衰老和癌变密切相关。端粒DNA由端粒酶控制合成，端粒酶是RNA依赖的DNA聚合酶，其激活使细胞获得永生化及可能恶性变，已证明多种肿瘤细胞具有很高的端粒酶活性^〔1〕。因而，研究肿瘤端粒酶具有重要价值。白血病是血液系统恶性克隆疾病，表现为细胞周期失控性增殖，其改变与端粒及端粒酶的异常有关。因而，检测白血病端粒酶活性，有助于白血病的病情分析和治疗。常用端粒酶活性分析方法是端粒重复扩增法(Telomeric Repeat Amplification Protocol,TRAP)^〔2〕通过电泳条带放射自显影定性测定，本文改用非放射硝酸银染色、吸光度半定量测定急性白血病细胞的端粒酶活性，并探讨其临床意义。

　　1　材料和方法

　　1.1　病例和细胞标本

　　我院收治初诊期和复发期急性白血病患者18例，按照FAB诊断分型标准，包括急性淋巴细胞白血病7例，急性粒细胞白血病11例。病例中有5例伴有高白细胞计数，白细胞数介于189.4～375.3×10⁹/L，见表1。阴性对照为正常人骨髓8份。阳性对照为U937白血病细胞系，本院保存。

表1　急性白血病临床资料与端粒酶检测

　　¹⁾为高细胞白血病病例

　　1.2　免疫分型及染色体检查

　　由本院血液实验室进行，13例进行免疫分型分别认证为淋系或髓系。15例进行染色体分析，9例具有异常核型，见表1。

　　1.3　制备细胞提取液

　　以肝素抗凝骨髓及外周血，淋巴细胞分层液离心分离单个核细胞。用含10%胎牛血清的RPIM 1640培养液(Gibco产品)培养U937细胞，收获细胞。高细胞白血病病例用CS-3000细胞分离机由外周血分离单个核细胞。各标本细胞以PBS制成细胞悬液，每10⁴～10⁶个细胞分别加入100 μl细胞裂解液，于冰浴中30 min后，4℃，16 000 r/min离心30 min，取上清。以考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，调整为5 mg/ml。-70℃保存或直接测定活性。

　　1.4　引物及主要试剂

　　TRAP用引物由本院合成，正向引物(TS)：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′，反向引物(CX)：5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTTA-3′。TaqDNA聚合酶及dNTPs等为Promega公司产品。

　　1.5　TRAP及吸光度测定

　　按Kim等^〔2〕建立的TRAP方法，以本院配制的试剂进行。反应管内依次加入TRAP混合液(20 mM Tris-HCL，pH 8.3，1.5 mM MgCl₂，63 mM KCl，0.005% Tween-20，1 mM EGTA，50 μM dNTPs，0.1 μg TS)47.2 μl，Taq酶2单位、细胞提取液2 μl，(U937细胞提取蛋白5 μg，正常人白细胞及白血病细胞提取蛋白5 μg)混匀，30℃反应30 min。再加入0.4 μlCX，石腊油20 μl。在PTC-51 B型DNA合成仪进行PCR扩增，反应条件为94 ℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行30个循环。扩增产物在12%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，硝酸银染色，观察DNA电泳梯度显色条带定性分析，然后以Bio-Rad图像分析仪对显色条带进行密度扫描，测定吸光度，打印电泳显色条带图象。

　　2　结果

　　根据TRAP扩增的DNA梯度电泳显色强弱及吸光度测定，18例急性白血病均具有较高的端粒酶活性，吸光度为240.58±106.73。其中伴有异常染色体的9个病例明显高于具有正常染色体的病例，吸光度分别为319.78±32.90和89.68±20.84，差异明显(P＜0.01)。5例伴有高细胞数的白血病患者标本吸光度测定为296.62±17.68。急性淋巴细胞白血病与急性粒细胞白血病之间，各免疫分型之间，不同幼稚细胞数病例之间无明显差别，见表1。阳性对照U937细胞株显示出明显活性，吸光度为236.48±96.67，正常骨髓细胞未显示出端粒酶活性。

　　3　讨论

　　端粒酶通过逆转录合成端粒重复序列。端粒酶活性增高代表永生化或失控性增殖的肿瘤细胞存在。分析端粒酶活性，有利于临床诊断和治疗。Kim等^〔2〕建立TRAP法测定端粒酶活性是通过扩增端粒重复序列，再经放射自显影来定性判断。在此基础上，改用硝酸银染色判断获得与TRAP放射显影同样的效果。为更精确地分析端粒酶活性，图象分析结合吸光度半定量分析，能较敏感地分析不同临床表现的白血病端粒酶活性改变。

　　端粒酶与白血病病变密切相关，可能作为白血病细胞的标志物。结果可见全部白血病患者表现较高的活性，与阳性对照U937白血病细胞株结果一致，正常对照则未见活性。表明端粒酶作为白血病的标志物，可能用于临床诊断。端粒酶较特异存在于肿瘤细胞，由于正常体细胞没有端粒酶活性，仅生殖细胞和造血干细胞有较低的活性^〔3〕。文中检测的病例显示出端粒酶活性，提示体内有不断增殖的白血病细胞，因而检测端粒酶活性可用于检测体内残留的白血病细胞。

　　白血病细胞内存在遗传变异，如染色体易位、缺失及倒位等异常。使基因重排并端粒酶激活，以参与修复染色体，并可能产生标志染色体^〔4～6〕。结果见9例白血病患者有染色体核型有易位、缺失及标志染色体等异常，同时表现有较高的端粒酶活性。另观察5例高细胞白血病也表现较高的端粒酶活性，其临床表现凶险，虽经分离外周血白细胞后，再进行临床常规治疗，仍难以缓解。其中2例进行染色体分析，有易位及缺失异常。提示端粒酶激活与染色体易位、缺失等异常和临床治疗及预后相关。由此推测细胞端粒酶异常可能是白血病病变的一种分子机制。端粒酶作为白血病细胞的标志物，将可能用于白血病的临床诊断和治疗。■

　　参考文献：

　　［1］Piatyszek M A,Kim N W,Weinrich S L,et al.Detection of telomerase activity in human cells and tumors by a telomeric repeat amplification protocol (TRAP).Methods Cell Sci,1995,17:1～15

　　［2］Kim N W.Piatyszek M A,Prowse K R,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.Sciences,1994,266:2011～2015

　　［3］Weng N P,Levine B L,June C H,et al.Regulated expression of telomerase activity in human T lymphocytes development and activation.J Exp Med,1996,183:2471～2479

　　［4］Vermeesch J R,Falzett D,Van Buggenhout G,et al.Chromosome healing of constitutional chromosome deletions studied by microdissection.Cytogenet Cell Genet,1998,81:68～72

　　［5］Kleyman S M,Parekh A J,Rodriguez A R,et al.Paracentric inversion involing the long arm of chromosome 9 resulting in deletion of ablgene.Am J Med Genet,1997,68:409～411

　　［6］Mondello C,Riboni R,Casati A,et al.Chromosomal instability and telomere length variations duringthe life span of human fibroblast clones.Exp Cell Res,1997,236:385～396

收稿日期：1999-06-28

修稿日期：1999-09-29