急性淋巴细胞白血病细胞增殖和耐药及凋亡与临床关系的研究

　　中华儿科杂志1999年第37卷第10期

　　郑胡镛　赵新民　巩文玉　耿兰增　吴敏媛　张永红　胡亚美

　　摘要　目的：观察急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿骨髓细胞增殖、多药耐药和凋亡与临床的关系。方法：用单克隆抗体检测细胞增殖性抗原（PCNA）、多药耐药糖蛋白（Pgp）和凋亡基因蛋白（Apo1）在ALL骨髓细胞的表达率，分析其在FAB、免疫分型和临床分型等各组之间的表达情况并进行了追踪观察。结果：PCNA、Pgp和Apo1的表达在FAB、免疫分型和临床分型等各组之间的差异均无显著性。一年无病生存患儿的PCNA、Apo1的表达明显高于死亡组患儿，而Pgp表达则明显低于死亡组。结论：PCNA和Apo1的高表达及Pgp的低表达提示患儿预后较好。

　　关键词：白血病　淋巴细胞性　急性　细胞分裂　抗药性　多药　脱噬作用

　　小儿急性淋巴细胞白血病(ALL)占小儿急性白血病的80%。ALL的临床表现及对治疗的反应和预后与白血病细胞的生物学特性密切相关。细胞增殖异常是肿瘤发生的基础，白血病细胞的多药耐药和凋亡受阻是导致白血病治疗效果不佳和复发的根本原因。因此本研究用抗细胞增殖性核抗原(PCNA)、多药耐药糖蛋白(Pgp)和凋亡基因蛋白(Apo1)的单克隆抗体(McAb)对小儿ALL的骨髓细胞进行了细胞增殖、多药耐药和凋亡的检测并探讨了与临床的相互关系。

　　对象及方法

　　一、对象

　　22份骨髓标本取自本院1996年11月～1997年4月住院的ALL患儿，男12例，女10例；平均年龄5.3岁(1.5～8.5岁)。观察PCNA、Pgp和Apo1在FAB分型、免疫分型和临床分型(高危型、标危型)等各组之间的表达情况^［1］，并对16例患儿进行了预后追踪观察。

　　二、标本采集

　　于初诊时抽取骨髓1 ml，肝素抗凝，淋巴细胞分离液Ficoll-Isopaque(上海生化试剂厂，比重1.007 g/ml)分离单个核细胞，磷酸盐缓冲液PBS洗2遍，用PBS调节细胞浓度至10⁶/ml。

　　三、单克隆抗体(简称单抗)试剂

　　McAb PCNA (荧光素PE标记) 购自丹麦Dako公司，Pgp和Apo1及荧光素FITC-羊抗鼠二抗购自法国Immunotech公司。

　　四、免疫标记

　　1. 膜抗原Pgp和Apo1标记：每支测定管加入细胞悬液100 μl(10⁵个细胞)，取Pgp和Apo1各10μl与细胞悬液混匀，4℃孵育30分钟，PBS洗2遍，加FITC-羊抗鼠荧光二抗，4℃孵育30分钟，PBS洗2遍，加1%多聚甲醛0.5 ml以固定细胞，待上机检测。每批检测均设阴性对照管（只含细胞悬液）和同性对照管（细胞悬液中加FITC-羊抗鼠荧光二抗，以排除非特异荧光结合的假阳性细胞）。

　　2. 核抗原PCNA标记：每测定管加入细胞悬液100 μl (10⁵个细胞)，加缓冲甲醛丙酮固定液（BFA）1 ml固定和膜打孔5分钟，加胎牛血清50 μl封闭15分钟。然后加入PE荧光标记的单抗PCNA10 μl，4℃孵育30分钟，PBS洗2遍，加1%多聚甲醛0.5 ml以固定细胞，待上机检测。每批检测均设阴性对照管（只含细胞悬液）和同性对照管（细胞悬液中加PE-IgG1，以排除非特异荧光结合的假阳性细胞）。

　　五、流式细胞仪分析

　　流式细胞仪FACScan(美国BD公司)的发射激光为氩离子激光器，功率为10 mW，发射波长488 nm。FITC荧光通过530/30 nm带通滤色片，PE荧光通过585/40 nm带通滤色片。每测定管收集10000个细胞。细胞检测采用lysysⅡ软件 (BD公司提供)，计算出阳性细胞百分率，结果用list mode方式储存在计算机软盘内。

　　六、 统计学处理

　　用SPSS软件将所有检测数据及病例相关资料建立数据库，免疫分型各组之间的抗原表达率用多个独立样本比较的秩和检验，其余各组之间的抗原表达率用两样本比较的秩和检验。

　　结果

　　一、PCNA、Pgp、Apo1的表达情况

　　22例初诊患儿的PCNA、Pgp和Apo1的表达率差异很大，呈非正态分布。其中位数及变化范围见表1。

表1　22例PCNA、Pgp和Apo1的表达比较(%)

　　 二、病例资料分析

　　22例初诊患儿按FAB分型、免疫分型、临床分型及CD13和CD34的有无分组，其PCNA、Pgp和Apo1表达在分组患儿之间的比较见表2。

表2　PCNA、Pgp、Apo1表达在分组患儿之间的比较

　　 ^*Pre-B：前B细胞型，^**Commom B：普通B细胞型，^△B-cell：B细胞型，^△△T-cell：T细胞型

　　经秩和检验，PCNA、Pgp和Apo1的表达在以上各分组之间差异均无显著性(P均＞0.05)。

　　三、预后分析

　　1. 初次缓解时间与PCNA、Pgp、Apo1表达的关系:诱导治疗后复查骨髓，3周内骨髓缓解与不缓解组患儿的PCNA、Pgp、Apo1表达差异均无显著性（P＞0.05）。

　　2. 一年追踪观察: 1998年4月的资料分析表明，22例患儿中，13例仍无病存活，3例死亡（均在诱导期并发感染，或水痘或败血症死亡），6例失访。对病情明确的16例患儿行PCNA、Pgp和Apo1表达，经秩和检验分析发现，13例无病存活组与死亡组之间的PCNA、Pgp和Apo1表达差异有非常显著意义（P＜0.01）（表3）。由表3中可以看出，无病存活组患儿PCNA和Apo1表达较高，而Pgp表达较低；死亡组患儿的表达情况正好相反。

表3　无病缓解一年组与死亡组的PCNA、Pgp、Apo1的表达

　　讨论　　一、 一年追踪观察结果分析

　　ALL患儿初诊时的PCNA、Pgp和Apo1的表达及一年追踪结果分析表明，无病存活组的PCNA和Apo1表达高于死亡组，而Pgp的表达低于死亡组。

　　PCNA是细胞增殖性抗原，是细胞核中分子量为36 000的酸性非组蛋白多肽，在细胞周期的G₁、S、G₂和M期表达，而在G₀期(即静止期)细胞中不表达^［2］。其增殖活性已被作为恶性肿瘤的分型和判断预后的指标^［3］。本研究结果表明，一年无病生存患儿的PCNA表达率明显高于死亡组患儿，并发现1例死亡患儿初诊时的PCNA表达率为0。作者在另一项研究中也发现，PCNA高表达的患儿预后较好^［4］。这与国外文献报道的PCNA表达率在实体瘤中的结果正相反，他们认为肿瘤细胞的PCNA表达越高，预后越差^［5］。我们认为小儿ALL细胞有其特有的生物学特性，这在小儿与成人ALL的治疗方面已得到证实。ALL细胞增殖活力越高，对药物的敏感性越强，治疗效果也越好。

　　Pgp是多药耐药(multidrug resistance, MDR)基因MDR1编码产生的一种高分子糖蛋白，分子量为170000，因此也叫P170，有1 280个氨基酸。他们的结构与已知的细菌膜转运蛋白相似，可与ATP结合，为主动转运过程提供能量，因此能逆浓度地将药物从细胞内泵出细胞外。Pgp在血液系统肿瘤中表达率不到10%，但其表达与化疗反应显著相关，即Pgp高表达的患儿预后不好^［6,7］。本研究结果发现，Pgp在小儿ALL细胞中的表达较低，22例患儿中只有2例患儿有Pgp的高表达，其中1例在诱导治疗期因不缓解并发败血症而死亡。一年无病生存患儿的Pgp表达率明显低于死亡组患儿，证明Pgp高表达的细胞对化疗药物不敏感，治疗效果差。

　　Apo1(CD95)是一种跨膜蛋白，由最早发现的凋亡基因Fas编码，属肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族。正常情况下，在Apo1抗体或Fas配体作用下，细胞快速凋亡^［8］。白血病的发生与细胞凋亡受阻有关，白血病细胞的耐药也与细胞不易凋亡有关，因此Apo1的低表达是白血病细胞抵抗化疗药物作用的机制之一。本研究发现，一年无病生存患儿的Apo1的表达率明显高于死亡组患儿，说明凋亡率高的细胞对化疗药物敏感，因而治疗反应较好。

　　二、其他结果分析

　　PCNA、Pgp和Apo1在FAB、免疫分型及临床分型等各组之间的表达差异无显著性。这可能是由于经过分组后病例数较少，如L₁只有1例，L₃只有3例，Pre-B、B-Cell和T-cell各只有2例，因而统计结果可信度较差。这有待于今后积累资料再行分析。

　　临床上治疗ALL，一般在诱导治疗3周左右复查骨髓以确定初次缓解情况。本研究结果提示，PCNA、Pgp和Apo1的表达与患儿初次缓解情况无关。这可能是因为随着越来越多的化疗药物的发现和化疗方案的发展，对ALL白血病细胞的诱导和杀伤力明显增强，即使临床高危型的ALL，通过多药联合和强化疗，也能达到与标危型相似的预后结果。近几年来，我院ALL患儿几乎都能100%达到初次缓解。因此，PCNA、Pgp和Apo1这些指标与FAB、免疫分型及临床分型等指标一样，在对ALL的初次缓解评估方面意义不大，但对一年以上的长期预后仍有预测价值。

　　总之，检测PCNA、Pgp和Apo1的表达有助于对白血病的治疗效果和预后的判断，即PCNA和Apo1高表达及Pgp低表达的患儿预后较好。

　　本课题由北京市科技新星基金资助（项目编号：951874900)

　　作者单位：100045　首都医科大学附属北京儿童医院血液专业组

　　参考文献

　　1　胡亚美.白血病.见：吴瑞萍，胡亚美，江载芳，主编. 诸福棠实用儿科学. 第6版.北京: 人民卫生出版社,1995. 2166-2185.

　　2　Tsurusawa M, Ito M, Zha Z, et al. Cell-cycle-associated expression of proliferating cell nuclear antigen and Ki-67 reactive antigen of bone marrow blast cells in childhood acute leukemia. Leukemia, 1992, 6: 669-674.

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　　4　郑胡镛，赵新民，耿兰增，等.儿童急性淋巴细胞白血病骨髓细胞增殖活力与预后观察研究.中华血液学杂志, 1999,20:3-5.

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　　8　Munker R, Lubbert M, Yonehara S, et al. Expression of the Fas antigen on primary leukemia cells. Ann Hematol, 1995, 70: 15-17.