姜黄素与5-氟尿嘧啶对人白血病K562细胞体外抗癌的协同作用
中药药理与临床 1999年第5期第15卷 实验研究
作者：赵 蓉 柯丹如 许建华 黄自强 陈元仲
单位：赵 蓉 柯丹如 许建华 黄自强 福建医科大学临床药理研究所 福州 350004；陈元仲 福建省血液病研究所 福州 350001
关键词： 姜黄素；5-氟尿嘧啶；人白血病K562细胞；协同作用
提 要 用MTT法及AO／EB荧光法观察了姜黄素与5-氟尿嘧啶对人白血病K562细胞体外抗癌的协同作用，结果发现姜黄素与5-氟尿嘧啶合用有相加甚至增强作用，尤其是对诱导细胞凋亡的协同作用更为突出，协同效果呈剂量依赖性增强。
Synergistic Antitumor Effects of Curcumin and 5-Fluorouracil on K562 Cell in Vitro
Zhao Rong, Ke Denru, Xu Jianhua, et al.
(Institute of Clinical Pharmacology, Fujian Medical University,Fuzhou 350004)
The synergistic antitumour effects of curcumin(Cur) and 5-Fluorouracil(5-Fu) on K562 cell in vitro were studied with MTT method and AO/EB fluorescent staining.It was found that the combinations of Cur and 5-Fu for 48h increased both inhibition rate and apoptosis rate to a greater extent than occurred for cell treated with either compound alone.
Key words curcumin;5-Fluorouracil;K562 cell;synergistic effect
作者前文报道［1，2］Curcumin (Cur)对MGC803、Bel7402、B16、K562、K562/ADM均有明显的体外杀伤作用，并使S期细胞的比例呈剂量依赖性提高。此药物能否对S期细胞选择性杀伤的抗代谢药物的作用未见报道。本文进一步研究Cur与5-氟尿嘧啶(5-Fu)体外协同抗肿瘤作用，探讨Cur与常用化疗药物合用的杀伤特点，为Cur的临床应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验药物 Cur按文献［1］由本所从福建建阳地区产的姜黄(Curcuma longa L.)中提取、分离，经硅胶薄层鉴定，与标准品的比移值相同。
1.2 药品与试剂 吖啶橙(AO)及溴乙锭(EB)为Fluka公司产品。5-Fu为南通制药总厂产品。RPMI 1640培养基为GIBCO产品。胎牛血清、小牛血清为上海轻工所产品。MTT为华美生物工程公司产品。酶标仪550为BIO-RAD产品。
1.3 细胞株及培养条件 人慢性粒细胞白血病K562细胞株为本室保种。用内含5%胎牛血清、8%小牛血清及100IU/ml青霉素，100μg／ml链霉素的RPMI 1640培养基培养、传代，取对数生长期细胞用于实验。
1.4 药物对癌细胞体外杀伤协同作用的测定［3］ 96孔培养板接种K562细胞，接种量0.5～2×104个／孔，同时加入等体积不同浓度的Cur及5-Fu溶液，设4个复孔。37℃培养48小时，加入5mg/ml的MTT溶液20μl／孔，继续培养4小时后，加入裂解液(10%SDS、5%异丁醇，用HCl调至pH4.5)，37℃放置过夜，用酶标仪测各孔的A550值。
1.5 药物诱导细胞凋亡协同作用的测定 细胞经Cur及5-Fu处理48小时后，用AO/EB荧光染料染色，按文献［4］的方法，在荧光显微镜下计数早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞，并计算凋亡率(早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数/计数细胞总数×100％)。
1.6 数据分析 按金氏公式［q＝Ea＋b／Ea＋Eb-Ea×Eb］评价两种药物合用是否有协同或拮抗作用［5］，式中Ea＋b为合用药物的有效率，Ea、Eb分别为A药、B药单独用药的有效率。若q值在0.85～1.15范围内为两药合用单纯相加，q值＞1.15为增强，q值＜0.85则表示两药合用有拮抗作用。
2 结果
2.1 Cur与5-Fu合用对K562细胞体外杀伤的协同作用 结果见表1，不同浓度Cur与5-Fu合用的抑制率均大于两药相应浓度单独使用的抑制率，且q值均＞1，表明两药合用对K562细胞体外杀伤有协同作用，尤其是5μg／ml Cur对5-Fu可产生增强作用。
表1 Cur与5-Fu对K562细胞杀伤的协同作用 (
±s)
| Cur
(μg/ml) |
5Fu
（μg／ml） |
OD值 |
抑制率
(%) |
Q值 |
| 0 |
0 |
1.1±0.040 |
|
|
| 5 |
0 |
0.5±0.014 |
53.8±1.3 |
|
| 10 |
0 |
0.4±0.017 |
61.9±1.5 |
|
| 0 |
10 |
1.0±0.013 |
7.1±1.2 |
|
| 0 |
20 |
1.0±0.019 |
8.6±1.7 |
|
| 0 |
40 |
0.9±0.033 |
15.1±3.0 |
|
| 5 |
10 |
0.4±0.014 |
61.9±1.3 |
1.13 |
| 5 |
20 |
0.3±0.015 |
67.3±1.3 |
1.17 |
| 5 |
40 |
0.3±0.037 |
68.2±3.3 |
1.21 |
| 10 |
10 |
0.3±0.008 |
67.1±1.6 |
1.11 |
| 10 |
20 |
0.3±0.013 |
72.4±1.2 |
1.11 |
| 10 |
40 |
0.2±0.004 |
74.4±0.3 |
1.10 |
表2 Cur与5-Fu协同诱导K562细胞凋亡
| Cur |
5-Fu
（μg／ml） |
凋 亡 率
(%) |
Q值 |
| 0 |
0 |
1 |
|
| 5 |
0 |
55 |
|
| 10 |
0 |
61 |
|
| 0 |
10 |
2 |
|
| 0 |
20 |
3 |
|
| 0 |
40 |
2 |
|
| 5 |
10 |
62 |
1.11 |
| 5 |
20 |
69 |
1.22 |
| 5 |
40 |
85 |
1.52 |
| 10 |
10 |
79 |
1.32 |
| 10 |
20 |
89 |
1.50 |
| 10 |
40 |
87 |
1.46 |
2.2 Cur与5-Fu合用对诱导细胞凋亡的协同作用 从表2可见，5-Fu 10～40μg／ml对K562细胞单独作用48小时，细胞凋亡率接近溶剂对照组，提示该药在本文条件下基本不诱导细胞凋亡。而Cur 5、10μg／ml单独作用48小时，则可引起显著的细胞凋亡，镜下见早期凋亡细胞核染色质被AO染色，呈绿色荧光，但细胞核呈固缩状或圆珠状。晚期凋亡细胞因细胞膜受损，EB可透入使核着桔红色荧光并呈固缩状，而非凋亡的坏死细胞核呈正常结构并着桔红色荧光，正常细胞核呈正常结构并着绿色荧光，当两药同时作用，可见其凋亡率均大于同浓度单一用药，且绝大多数组合的q值大于1.15，属于增强作用。
从表2还可发现，Cur与5-Fu合用诱导凋亡的效果(q值)对两药呈剂量依赖性提高。但Cur 10μg／ml对5-Fu 20μg／ml诱导细胞凋亡的协同作用已达到坪值，5-Fu浓度再提高，协同效果不再随之提高。3 讨论
Cur与常用化疗药物的协同作用未见报道，作者前文［1］报道Cur对K562等肿瘤细胞株的细胞周期进程有阻断作用，可使S期细胞的比例呈剂量依赖性升高。为此，本文对Cur与主要作用于S期的抗代谢药物5-Fu的协同作用进行探讨。结果显示，不论是以MTT法测定药物体外杀伤作用，还是以诱导细胞凋亡为指标，Cur与5-Fu在体外均有相加甚至增强作用，尤其是在诱导细胞凋亡方面，绝大多数联合用药组合的q值大于1.15，表明二者的协同主要表现为增强作用，而且协同效果呈二药剂量依赖性提高。5-Fu在临床上不常用于慢性粒细胞白血病的治疗，从本文结果也可看出5-Fu对K562细胞的体外抗癌作用较弱，表明该细胞株对5-Fu存在一定程度的天然抗药性。Cur与5-Fu对K562细胞的体外协同作用表明Cur可部分逆转K562细胞对5-Fu的天然抗药性。Cur对K562敏感的化疗药物如马利兰、阿霉素、鬼臼毒素衍生物等的协同作用也值得进一步研究，以期为临床应用提供实验根据。
注：福建省自然科学基金重点资助课题，编号 K96037
参考文献
1 许建华，赵 蓉，柯丹如，等.姜黄素对人白血病K562细胞凋亡的影响.中药药理与临床，1998；14(6)∶19
2 许建华，赵 蓉，柯丹如，等.姜黄素对人肝癌Bel7402细胞杀伤动力学及周期时相的影响.福建医科大学学报，1998；32(3)∶236
3 周建军，乐秀芳，韩家娴，等.评价抗癌物质活性的改良MTT方法.中国医药工业杂志，1993；24(10)∶455
4 陈丽娟，盛瑞兰，汪承亚，等.AO/EB荧光染色法测定阿糖胞苷诱导HL60细胞凋亡.中华血液学杂志，1998；19(1)∶41
5 金正均.合并用药中的相加.中国药理学报，1980；1(2)∶70
用户登录 
新用户注册