慢性粒细胞白血病急变与p16及降钙素基因关系的研究

中华肿瘤杂志 2000年第2期第22卷 临床研究

作者：许多荣　洪文德　王顺清　童秀珍　彭爱华　罗绍凯　安业浩

单位：许多荣（中山医科大学附属第一医院血液科，广州，510080）；洪文德（中山医科大学附属第一医院血液科，广州，510080）；王顺清（中山医科大学附属第一医院血液科，广州，510080）；童秀珍（中山医科大学附属第一医院血液科，广州，510080）；彭爱华（中山医科大学附属第一医院血液科，广州，510080）　　　　　罗绍凯（中山医科大学附属第一医院血液科，广州，510080）　　　　　安业浩（中山医科大学附属第一医院血液科，广州，510080）

　　关键词： 白血病，慢性粒细胞；p16基因；降钙素基因

　　【摘要】　目的　探讨p16基因纯合缺失、降钙素基因(CT基因)高度甲基化与慢性粒细胞白血病(CML)急变之间的关系。方法　分别采用半定量多重PCR、半定量PCR检测了20例正常人和53例CML患者p16基因纯合缺失和CT基因高度甲基化。结果　在53例CML中，慢性期组、急粒变组、急淋变组、混合细胞急变组，p16基因纯合缺失、CT基因高度甲基化的阳性率分别为0%(0/20)、6.2%(1/16)、66.7(8/12)、40.0%(2/5)和10.0(2/20)、68.8%(11/16)、16.7%(2/12)、40.0%(2/5)。结论　CML急淋变、急粒变分别与p16基因纯合缺失、CT基因高度甲基化存在密切关系，而混合细胞急变与两种基因同时异常有关。同时检测这两种基因异常，有助于预测CML早期发生急变。

Relationship between blast crisis of chronic myeloid leukemias and abnormality of p16 and calcitonin genes

XU Duorong, HONG Wende, WANG shunqing, et al.

　　（Department of Hematology, The First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen university of Medical Sciences, Guangzhou 510080， China）

　　【Abstract】　Objective　To study the relationship between homozygous deletions of p16 gene and calcitonin hypermethylation and chronic myeloid leukemia (CML) blast crisis.Methods　Semiquantitative multiplex polymerase chain reaction (PCR) was used to detect homozygous deletions of p16 gene and semiquantitative PCR to detect calcitonin gene hypermethylation in 53 CML patients.Results　In 53 CML patients, homozygous deletion of p16 gene was found in none of them in chronic phase, while in 6.3% (1/16) of them in myeloid blast crisis, 66.7% (8/12) in lymphoid blast crisis, and 2/5 (40%) in mixed cell blast crisis. Calcitonin gene hypermethylation was found in 10% (2/20), 68.8%(11/16), 16.7%(2/12), and 40%(2/5), respectively.Conclusion　There is intimate relationship between homozygous deletions of p16 gene and CML in lymphoid blast crisis, between calcitonin gene hypermethylation and CML in myeloid blast crisis. Moreover, abnormality of both genes may be associated with mixed cell blast crisis in CML patients. Simultaneous detection of the two genes help early pickup CML patients in blast crisis.

　　【Subject words】　Leukemia, chronic myeloid;　p16 gene;　Calcitonin gene

　　p16基因是一新揭示的抑癌基因^［1］，位于9p21，全长8.5 kb，含3个外显子，其编码的p16蛋白主要功能是竞争性结合细胞周期素依赖性激酶(CDK)抑制RB蛋白的磷酸化，控制细胞周期从G₁期进入S期。降钙素基因(CT基因)位于11p15，长39 kb，5′端具有高含量的C+G和多个CCGG位点^［2］，CCGG位点高度甲基化与不少肿瘤发生有关。本研究采用半定量PCR同时检测了53例CML患者的p16基因纯合缺失和CT基因高度甲基化，现将结果报告如下。

　　材料与方法

　　1.材料：20例正常人，男性13例，女性7例，平均年龄29.8岁。53例CML患者，男性36例，女性12例，平均年龄32.6岁。其中慢性期组20例，急粒变组16例，急淋变组12例，混合细胞急变组5例。K562细胞株为p16基因纯合缺失细胞株，作为p16基因纯合缺失的阳性对照，凝血因子IX基因外显子4作为内对照，引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成。引物序列见表1。

　　2.方法：

　　(1)DNA提取：取骨髓或外周血5 ml，用淋巴细胞分离液收集单个核细胞(MNC)，常规方法提取DNA，并进行浓度和纯度测定。

　　(2)半定量多重PCR检测p16基因纯合缺失：将E₁(E₂)和E₄放在一个体系中进行多重PCR扩增。反应总体积50μl，含1.5 U Taq DNA酶，DNA 200 μg，E₁(E₂)和E₄引物量分别为25 pmol/L和50 pmol/L。PCR循环条件：E₁+E₄：94℃ 1 min，58℃1 min，72℃ 1.5 min；E₂+E₄：94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃1.5 min，两者均为35个循环。DNA扩增产物先经2%琼脂糖凝胶电泳(正常人应扩增出两条带，第一条为内对照凝血IX因子基因外显子4扩增产物，长度为273 bp，第二条为p16基因外显子1或外显子2扩增产物，长度为336 bp或393 bp)，然后在紫外灯下摄像，负片送TCL薄层扫描仪扫描，测出两条产物带的吸光度A(曾称光密度OD)，计算其比值，即A₁/A₄和A₂/A₄(A₁、A₂、A₄分别表示p16基因外显子1、p16基因外显子2、凝血IX因子外显子4扩增产物光密度扫描值)。以3倍的K562细胞DNA和1倍正常人细胞DNA多次混合扩增后两条产物光度比值的平均值作为标准值，评价其他病例，评价方法参阅国外Sill等^［3］方法。本实验测得的标准值分别为₁(A₁/A₄)=1.1716±0.0913，₂(A₁/A₄)=1.1680±0.0841。如果在一CML患者中测得的A₁/A₄(A₂/A₄)比值＜₁(₂)，则可认为此病例属p16基因外显子1(外显子2)纯合缺失。

表1　不同基因片段引物序列

　　(3)半定量PCR检测CML患者CT基因高度甲基化：DNA酶切：反应总体积50μl，DNA 1 μg，Hpa Ⅱ内切酶10 U，37℃水浴16 h。PCR扩增：反应总体积50μl，5 μl酶切产物，Taq DNA酶1.5 U，CT基因特异片段引物量为12.5 pmol/L，94℃变性，55℃退火，72℃延伸各1 min，总共35个循环。正常人PCR产物经琼脂糖电泳出现两条带(一条为特异性产物，长度为566 bp；另一条为非特异产物，长度为639 bP，作内对照)，然后在紫外灯下摄像，负片送薄层扫描仪扫描，计算两条产物带的光密度比值(A566/A 639)。如果某一CML患者测得A 566/A 639比值≥1，则可认为此病例属CT基因高度甲基化。方法和标准值参考国外Fukuhuman等^［4］方法。

　　(4)统计学分析：采用四格表χ²检验和确切概率计算法。结果

　　1.正常人p16基因纯合缺失和CT基因高度甲基化检测结果：20例正常人中无p16基因外显子1和外显子2纯合缺失，也无CT基因高度甲基化(表2)。

表2　53例CML患者p16基因纯合缺失、CT基因高度甲基化检测结果

　　2.CML患者p16基因纯合缺失检测结果：在53例CML中，慢性期组、急粒变组、急淋变组、混合细胞急变组，p16基因纯合组缺失的阳性率分别为0%(0/20)、6.2%(1/16)、66.7%(8/12)、40.0%(2/5)。且所有缺失的病例外显引子1和外显子2均同时发生缺失。各组之间，只有急淋变组与正常人组比较差异有显著性(P＜0.05)。其中，在急淋变组和混合细胞急变组p16基因纯合缺失的病例中，各有1例分别在加速期前第4个月、第3个月均发生了p16基因缺失(表2，图1，2)。

图1　9例CML患者(L₁～L₉)p16基因外显子1多重PCR扩增电泳图

　　3.CML患者CT基因高度甲基化检测结果：53例CML中，慢性期组、急粒变组、急淋变组、混合细胞急变组，CT基因高度甲基化的阳性率分别为10.0%(2/20)、68.8%(11/16)、16.7%(2/12)、40.0(2/5)，只有急粒变组与正常人组比较差异有显著性(P＜0.05)。在急粒变组和混合细胞急变组8例CT基因高度甲基化的病例中，各有1例在加速期前发生了CT基因甲基化，最早的一例发生在加速期前7个月(表2，图3)。

图2　9 例CML患者(L₁～L₉)p16基因外显子2多重PCR扩增电泳图

图3　4 例CML患者(L₁～L₄)降钙素基因甲基化PCR扩增电泳图

　　讨论

　　CML是起源于多能造血干细胞的肿瘤性疾病。自然病程可分慢性期、加速期、急变期三个明显不同的时期。bcr/abl融合基因在慢粒发病机制中起重要作用，但与急变关系不大，ras基因和p53基因在急变期发生率也不高。本实验发现，p16基因纯合缺失，CT基因高度甲基化分别在CML急淋变、急粒变中存在较高阳性率，与正常人比较，p16基因纯合缺失只与CML急粒变存在相关性，而CT基因高度甲基化只与CML急粒变有关，且两种基因同时发生异常，部分患者出现了混合细胞急变。国外Sill等^［3］报道CML急淋变患者中p16基因纯合缺失阳性率也较高。对p16基因纯合缺失与慢性急淋变这种密切关系，目前主要认为，淋巴细胞内存在某些特殊机制(如DNA重组酶活性增强)，如果p16基因出现纯合缺失，使细胞内缺乏p16蛋白，则竞争的CDK活性增强，从而使淋巴细胞性肿瘤增殖加快，而粒系肿瘤细胞增殖相对减慢，在细胞永生的过程中淋巴细胞性肿瘤获得优势，最终转变为急淋变。在CT基因高度甲基化方面，国内王顺清等^［5］曾报道80%的CML急变期患者出现CT基因高度甲基化，但其未就急变类型作进一步分析。本研究发现，CT基因高度甲基化主要发生在CML急粒变中。CT基因高度甲基化与CML急粒变的这种关系目前尚不清楚，需进一步研究。本研究还发现，在急淋变组和混合细胞急变组10例p16基因纯合缺失的病例中，有2例分别在加速期前第4个月、第3个月就发生了p16基因纯合缺失。而在急粒变组和混合细胞急变组8例CT基因高度甲基化的病例中，有2例也在加速期前发生了CT基因甲基化，最早的一例发生在加速期前7个月。国外Malinen等^［6］认为，CT基因甲基化可在CML急变出现临床表现或细胞形态学改变前6个月发生。在临床上，利用部分患者在急变前就出现了p16基因纯合缺失、CT基因高度甲基化这一特点，若同时检测这两种基因异常，则可预测部分患者将发生急淋变、急粒变或混合细胞急变，以便及时采取有效的治疗措施，如强烈化疗或骨髓移植等，以提高治愈率。

　　参考文献：

　　［1］　Kamb A, gruis NA, weaver FJ, et al. A cell regulator potentially inovled in genes is of many tumor types. Science, 1994, 246: 436-440.

　　［2］　Bround PM, Symes AJ, Thakker RV, et al. Structure and methylation of the human calcitonin/ a-CGRP geme. Nucleic Acids Res, 1989, 17: 6999-7005.

　　［3］　Sill A, Goldman JM, Cross NC, et al. Homozygous deletions of the p16 tumor suppressor gene are associated with lymphoid transformation of chornic myeloid leukemia. Blood. 1995, 85: 2013-2016.

　　［4］　Fukuhuman T, Hooper WC, Baylin SB, et al. Use of the polymerase chain reaction to detect hypermethylation in the calicitonin gene: a new, sensitive approach to monitor tumor cells in acute myelogenous leukemia. Leuk Res, 1992,16: 1031-1036.

　　［5］　王顺清，洪文德，彭爱华.慢性粒细胞白血病降钙素基因甲基化的研究.中华血液学杂志，1998，1：30-31.

　　［6］　Malinen T, Palotie A, Pakkala S, et al. Acceleration of chronic myeloid leukemia coreelates with calcitonin gene hypermethylation. Blood, 1991,77: 2435-2440.

收稿日期：1999-04-15