端粒酶活性在卵巢肿瘤组织中表达的临床意义

　　西北国防医学杂志2000年第21卷第4期

杨秀芝　陈必良　苏明权　辛晓燕　王德堂

　　摘　要：目的：研究测定端粒酶活性在诊断和预测卵巢肿瘤方面的意义。方法：应用PCR－TRAP法检测30例卵巢肿瘤组织(良性组织8例，交界性或低度 恶性肿瘤7例，恶性肿瘤15例)的端粒酶活性。结果：8例卵巢良性组织中均未测出端粒酶活 性，7例卵巢交界性或低度恶性肿瘤组织中，4例(57％)端粒酶活性阳性表达，15例卵巢恶性肿 瘤组织中，14例(93.3％)端粒酶活性阳性表达。卵巢上皮性恶性肿瘤组织中，在组织类型、组 织学分级及肿瘤分期之间无显著性差异。结论：端粒酶活性的检测不仅有助于卵巢肿瘤的诊断和鉴别诊断，且有助于预测患者的预后。

　　关键词：卵巢肿瘤；端粒酶活性；表达

　　无限增殖是癌细胞的重要生物学特性。研究发现端粒酶与细胞分裂及寿命控制有密切关系，在细胞癌变早期由于端粒酶的活性增强，致使端粒的长度得以维持，细胞染色体形态得到稳定，从而逃避了因端粒缩短而引起的细胞死亡，使细胞获得永生化^［1］。端粒酶活性在人体多数肿瘤组织中均获检出。我们采用端粒重复扩增PCR(PCR－TRAP)方法对我院30例卵巢肿瘤组织进行端粒酶活性检测，了解端粒酶活性在卵巢肿瘤组织中的表达及在诊断和预测卵巢肿瘤预后方面的意义。

　　1　材料和方法

　　1．1　材料

　　1．1．1　组织标本来源：30例卵巢肿瘤组织 均为我院1999－03～09手术切除标本，包括8例卵巢良性肿瘤，7例交界性肿瘤，15例恶性肿瘤。所有病例均经病理学证实。获取的新鲜组织标本立即置－20℃冻存。

　　1．1．2　端粒酶检测试剂：由Oncor公司提 供。

　　1．2　方法

　　1．2．1　端粒酶的提取：手术切除的卵巢肿 瘤组织50 mg，置液氮速冻后用组织研磨器研成粉末，PBS缓冲液洗涤一次，10 000 g·min^－1离心1 min，弃洗液，加入100 μl 预 冷的裂解液(10 mmol·L^－1 tris－HCL pH7.5;1 mmol·L^－1 EGTA；1mmol·L－1二巯基乙醇；0.5％CHAPS；10％甘油5)，混合后冰浴裂解30 min，12000 g·min －14℃离心20 min，上清即为端粒酶提取物，或－20℃保存备用。

　　1．2．2　PCR扩增：PCR反应总体积为50 μl ，包括10×TRAP反应液5.0μl，2.5 mmol· L^－1 dNTPs mix 1.0 μl，Ts引物1.0 μl，Taq dNA聚合酶2U，端粒酶提取物2.0 μ l，无菌石蜡油30 μl，离心片刻，置30℃反应30 min后，加CX引物1.0 μl，进入PCR循环 ，循环条件为：94℃3 min→94℃30 s→48℃30 s→72℃30 s，35次循环，最后72℃延伸5 m in。

　　1．2．3　产物的检测：取PCR扩增产物15 μ l，于10％非变性聚丙烯酰胺凝胶200V电泳90 min，将凝胶小心取出置于0.1 μg·ml^－1的EB液中染色15 min，再用蒸馏水漂洗 两次，紫外灯下观察结果并拍照。反应以TSR8阳性模板为阳性对照，含36 bp的内对照(Oncor 公司)，1×CHAPS裂解液代替组织裂解液为空白对照，每一样品均设立端粒酶热失活对照(PC r－TRAP反应前将细胞裂解物于85℃处理15 min，使端粒酶失活)。

　　1．2．4　统计学处理：采用χ²检验进行统计学处理。

　　2　结果

　　2．1　卵巢肿瘤组织中端粒酶活性的表达：8例卵巢良性肿瘤组织中：包括卵巢粘液性囊腺瘤2例，卵巢浆液性囊腺瘤2例，卵巢血管平滑肌瘤2例，卵巢子宫内膜异位囊肿2例，端粒酶活性均呈阴性。在7例交界性或低度恶性卵巢肿瘤组织中，包括2例交界性粘液性囊腺瘤，2例交界性浆液性囊腺瘤，2例支持细胞瘤，1例粒层细胞卵泡膜细胞瘤，4例端粒酶阳性表达，3例端粒酶为阴性。在15例卵巢恶性肿瘤组织中，包括卵巢浆液性囊腺癌6例，粘液性囊腺癌2例，子宫内膜样癌4例，恶性畸胎瘤1例，转移性癌2例，14例端粒酶活性阳性表达，1例端粒酶活性为阴性。结果见表1。

表1　　卵巢肿瘤组织中端粒酶活性表达

　　注：compared to benign:P＜0.05

　　2．2　端粒酶活性与肿瘤组织学的关系：虽然我们的方法是端粒酶活性的定性检测，但发现卵巢恶性肿瘤的端粒酶活性与肿瘤的组织类型、组织分级、肿瘤分期无明显的相关性。3　讨论

　　自1994年Kim^［2］建立了高效敏感的以PCR为基础的端粒重复扩增(TRAP)方法以来，端粒酶引起了人们的广泛关注。近年文献报道，绝大部分肿瘤呈端粒酶酶阳性，而在邻近正常人体组织细胞或良性肿瘤则为阴性^［3］，在恶性肿瘤针吸标本、尿液、肠道冲洗液中，端粒酶活性的检测也有较高的表达，有助于肿瘤的早期诊断^［4］。Hiyama等^［5］对乳腺癌、胃癌病人的研究发现，端粒酶阳性者肿瘤体积大，淋巴结转移率高，预后差。端粒酶活性与肿瘤的大小、淋巴结的转移、肿瘤的分级和预后密切相关。提示端粒酶阳性的肿瘤比阴性的肿瘤有更大的恶性倾向。但本组发现端粒酶活性与肿瘤组织学类型、分级及分期无明显相关性，其原因目前尚不清楚。在胃癌、乳腺癌、肠癌、甲状腺癌、肺癌中，随肿瘤的恶性表型的增加，端粒酶活性的检出率和强度也增加^［6，7］。1994年Counter等^［8］首次报道晚期卵巢上皮癌腹水细胞端粒酶阳性，此后Zheng等［9］检测了多种妇科肿瘤，发现恶性妇科肿瘤端粒酶阳性率达95％以上，而在正常对照组或良性妇科肿瘤中均为阴性，认为端粒酶检测可作为生殖道恶性肿瘤的标记物。Muraka mi^［10］等采用TRAP法发现25例恶性卵巢肿瘤中有23例(92％)表达端粒酶活性，6例交界性肿瘤有1例为端粒酶阳性，10例良性肿瘤中有2例端粒酶阳性，恶性和低分化卵巢肿瘤活性较其它肿瘤端粒酶恶性高得多。作者发现：8例卵巢良性肿瘤组织，端粒酶活性均呈阴性。此结果与文献报道^［9］不太相符，我们认为可能与所检测标本量的多少有关。但在7例交界性或低度恶性卵巢肿瘤组织中，4例端粒酶阳性表达，3例端粒酶活性为阴性。这些结果与文献报道^［9，10］基本一致，显示端粒酶活性的改变可以作为恶性肿瘤的早期分子生物学标志，其活性的测定对卵巢恶性肿瘤的早期诊断和鉴别诊断起重要作用，对估计患者预后也有重要意义。

　　作者简介：杨秀芝(1966-)，女，主治医师杨秀芝(第四军医大学西京医院，陕西 西安　710033)

　　陈必良(第四军医大学西京医院，陕西 西安　710033)

　　苏明权(第四军医大学西京医院，陕西 西安　710033)

　　辛晓燕(第四军医大学西京医院，陕西 西安　710033)

　　王德堂(第四军医大学西京医院，陕西 西安　710033)

　　参考文献：

　　［1］Blackburn EH.Telomerase:no end in sight［J］.Cell,1994,7:621－623．

　　［2］Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of h uman telom erase activity with immortal cells and cancer［J］.Science,1994,266:2011．

　　［3］Zhang W,Kapusta LR,Slingerland JM,et al.Telomerase activity i n prostate cancer,prostatic intraepthelial neoplasia,and benign prostatic epithelium［J］. cancer Res,1998,58:619．

　　［4］Yoshida K,Sugino T,Goodison S,et al.Detection of telomerase a ctivity in exfoliated cancer cells in colonic luminal washings and its related clinical im plication［J］.Br J Cancer,1997,75:548－553．

　　［5］Hiyama E,Yokoyama T,Tatsumoto N,et al.Telomerase activity in gastric cancer［J］.Cancer Res,1995,55(15):3258－3262．

　　［6］Yashima K,Litzky LA,Kaiser L,et al.Telomerase expression in r espiratory epithelium during the multistage pathogenesis of lung carcinomas［J］.Cancer rds ,1997,57:2373－2377．

　　［7］张方信，邓芝云，张学庸，等，．大肠癌组织中的端粒酶活性变化［J］．西北国防医学杂志，1999，20(2)：89－91．

　　［8］Counter CM,Hirte HW,Bacchettis,et al.Telomerase activity in h uman ovarian carcinoma［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:2900．

　　［9］Zheng PS,Iwasaka T,Yamaski F,et al.Telomerase activity in gyn ecologic tumors［J］.Gynecol Oncol,1997,64:171．

　　［10］Murakami J，Nagai N,Ohama K,et al.Telomerase activity in o varian tumors［J］.Am cancer Society,1997,6:1085－1091．