卵巢肿瘤组织中nm23的表达和突变与其浸润转移的关系
肿瘤 1999年第4期第19卷 医疗研究
作者：李 力 张洁清 赵仁峰 姚德生 唐步坚 何靖育 陈心秋 古明华
单位：李力 张洁清 姚德生 唐步坚 陈心秋 古明华 广西医科大学附属肿瘤医院妇科(南宁 530021)；赵仁峰 何靖育 广西自治区人民医院妇产科
关键词：卵巢肿瘤；基因表达；肿瘤转移；聚合酶链反应；基因，nm23
卵巢癌极易在早期发生浸润和转移，是导致初诊时70%已为晚期病人，60%的患者在首次手术时肿块直径超过10 cm，并且有转移灶的重要原因［1］。nm23基因是近年来分离鉴定的一种与抑制肿瘤转移相关的基因［2］。为了探讨nm23基因的高表达与卵巢肿瘤浸润转移的关系，作者采用RNA聚合酶链反应(RT-PCR)以及多聚酶链反应-单链构象多态性分析技术(PCR-SSCP)对41例卵巢癌，20例卵巢良性肿瘤和21例正常对照组织中的nm23基因高表达以及突变进行检测。现将结果报告如下。
材料与方法
一、研究对象 全部标本均取自本科和广西自治区人民医院1996年3月～1997年5月住院患者的手术切除标本，并经病理学检查确诊。分为(1)卵巢恶性肿瘤组，共41例其中上皮性肿瘤33例(粘液性癌10例，浆液性癌11例，内膜样癌2例，低分化腺癌10例)，非上皮性肿瘤8例(内胚窦瘤3例，无性细胞瘤2例，颗粒细胞瘤，未成熟畸胎瘤，睾丸母细胞瘤各1例)。临床分期按FIGO标准(1988年)，其中Ⅰ期12例，Ⅱ期4例，Ⅲ期22例，Ⅳ期3例。全部病例均接受手术加术后规则化疗，随访最短6个月，最长20个月，疗效评定按WHO四级评定标准［3］。(2)卵巢良性肿瘤组，共20例，其中粘液性瘤6例，浆液性瘤8例，良性畸胎瘤6例。(3)正常卵巢组，共21例均来自子宫肌瘤手术同时行卵巢切除，病理学检查正常者。
二、组织标本收集及处理 全部标本均在手术时收集，除一部分作常规组织病理学检查外，其余立即放入液氮中保存待检。恶性肿瘤除在原发灶取材外，其中23例同时在癌旁和转移灶取材。
三、nm23表达的检测方法 1.组织总RNA的提取和cDNA的合成：组织中总RNA的提取采用酸性异硫氰酸胍一步法［4］。提取的总RNA加适量经二乙基焦酸盐(DEPC)处理的去离子水溶解，取其中10 μl经1.0%琼脂糖电泳鉴定及紫外分光光度计定量，计算吸光度A260/A280比值，检测RNA纯度，比值均大于1.80。取1 μg总RNA合成cDNA。逆转录cDNA试剂盒由Promega公司提供，按说明书操作。2.PCR扩增：(1)寡核苷酸引物制备，引物的设计参考文献［5］。由中科院上海生物工程研究中心合成，具体序列如下：
nm23-H1：5′-GCAGCCGCAGTTCAAACCTAA-3′
3′-GCTGGGAGGAAGCATTTTAATCA-5′
nm23-H2：5′-CACCTTCATCGCCATCAAGCCG-3′
3′-CCACCTCTTATTCATAGACACC-5′
nm23-H1及H2引物扩增DNA目的片段分别为685和475bp。(2)PCR扩增反应：取4 μl(100 ng)反转录cDNA作PCR扩增，总反应体积20 μl。含25 mmol/L MgCl2；10× PCR Buffer；10 mmol/L dNTPs；2u Taq DNA聚合酶；nm23-H1引物1.2 pmol，nm23-H2引物0.7 pmol。PCR扩增反应采用三阶温控法，nm23-H1为：94℃变性60s、56 ℃复性60 s，72℃延伸90 s，经33个循环后，72 ℃延长5 min。nm23-H2：94℃变性60 s，55 ℃复性60 s，72 ℃延伸90 s，经30个循环后，72 ℃延长5 min。(3)PCR产物电泳，采用非变性聚丙烯凝胶(PAG)电泳，方法参考文献［6］。3. PCR结果判断：PCR扩增产物经电泳分离后，以PCR-Marker分子量参照物(华美和物工程公司提供)对比碱基对大小。以出现明显的与目的基因碱基相同的区带(nm23-H1为685 bp，nm23-H2为475 bp)为阳性，见图1和2。
图1 nm23-H1基因RT-PCR结果
1：为PCR-marker分子量；2：阴性对照；3：正常组
4，5：恶性肿瘤；6：良性肿瘤
图2 nm23-H2基因RT-PCR结果
1：为PCR-marker分子量；2：阴性对照；3，4：恶性肿瘤
5：良性肿瘤；6：正常组织
四、nm23突变的检测方法 采用PCR-SSCP法，方法参考文献［6，7］。用0.1%硝酸银染胶，显带后立即拍照观察，见图3。
图3 nm23-H1基因PCR-SSCP银染结果
1：为PCR-marker分子量；2：正常对照；
3：恶性肿瘤；4：良性肿瘤；
五、统计学分析 采用χ2检验进行率的比较。
结果
一、各组中nm23 mRNA的表达情况
卵巢恶性肿瘤组织中nm23-H1和nm23-H2表达率分别为73.2%(30/41例)和70.7%(29/41例)，明显高于卵巢良性肿瘤(35.0%，7/20例和40.0%，8/20例)和正常卵巢组织(28.6%，6/21例和33.3%，7/21例)，相比较，差异有显著性(P＜0.01～0.05)。
二、卵巢恶性肿瘤nm23 表达与临床期别的关系
Ⅰ～Ⅱ期患者组织中nm23-H1和H2的表达率均为93.8%(15/16例)明显高于Ⅲ～Ⅳ期患者的60.0%(15/25例)和56.0%(14/25例)；相比较，差异有显著性(P＜0.05)。
三、卵巢恶性肿瘤nm23表达与病理分类及分级的关系
在33例上皮性癌中nm23-H1和H2表达率分别为72.7%(24/33例)和69.7%(23/33例)；8例非上皮性癌中nm23-H1和H2表达率分别为6/8和5/8例；两者相比较，差异无显著性(P＞0.05)；在病理分级中，高中分化者nm23-H1和H2表达率分别为77.8%和74.1%，而低分化者为70.0%和60.0%，相比较，差异也无显著性(P＞0.05)。
四、卵巢癌原发癌灶、癌旁及转移灶中的nm23表达情况
原发癌灶中nm23-H1和H2表达率为70.7%(29/41例)，65.9%(27/41例)；癌旁组织为26.1%(6/23例)和30.4%(7/23例)；转移灶为30.4%(7/23例)和26.1%(6/23例)。相比较，原发灶的nm23-H1和H2表达率均明显高于癌旁与转移灶(P＜0.01)；但癌旁与转移灶相比较，其表达率差异无显著(P＞0.05)。
五、卵巢恶性肿瘤nm23表达与近期疗效的关系
对治疗有效(CR+PR)患者组织中nm23-H1和H2表达率为83.3%(25/30例)和80.0%(24/30例)，而对治疗效果差者(NC+PD)的表达率为45.5%(5/11例)和36.3%(4/11例)；相比较，差异有显著性(P＜0.05)。
六、各组中nm23突变情况
21例正常卵巢和20例卵巢良性肿瘤无1例发生突变。41例恶性肿瘤组织中，3例nm23-H1突变，其中2例为低分化腺癌，1例为浆液性癌；2例为Ⅲ期患者，1例为Ⅳ患者。3例nm23-H2突变，其中低分化腺癌，粘液性和浆液性癌各1例；3例均为Ⅲ期患者。
讨论
本研究结果显示，卵巢癌组织中nm23-H1和H2的表达率高于良性及正常对照，同时显示不同病理类型及分级的nm23表达率无显著性差别，这与Srivatsa等［8］研究报道一致。这表明nm23与多数其它癌基因表达的特征相似，它的过度表达仅与组织细胞的恶性变有关。
本组资料观察的结果显示：(1)Ⅰ～Ⅱ期患者组织中nm23-H1和H2表达率明显高于Ⅲ～Ⅳ期。(2)原发癌灶组织中nm23-H1及H2表达率也明显高于转移灶，这些结果提示，卵巢恶性肿瘤组织中的nm23表达与其转移浸润有关。已有研究表明，nm23在恶性肿瘤组织中起着抑制转移的作用，它的编码产物在癌细胞中起初增高，当肿瘤出现转移时降低［2］。
本研究也发现，癌旁组织中nm23-H1及H2的表达率明显低于原发灶，这可能与(1)活检标本含有较多的正常细胞；(2)癌旁组织发生浸润的癌细胞本身的nm23表达水平降低有关。
nm23-H1和H2两个亚型，究竟谁起主要作用，目前尚不清楚，但有报道H1及H2可能有两个独立的调节系统［9］。也有研究结果表明H2与肿瘤的转移浸润更密切［8］。但本组资料结果尚未发现两者在卵巢癌浸润转移中的差异，因此，对于两者之间的作用机理还有待进一步研究。
本研究发现，卵巢恶性肿瘤组织中nm23-H1和H2的突变率仅为7.3%。而全部出现在Ⅲ～Ⅳ期患者。这与Mandai［10］等的研究结果大致相同。有学者认为nm23突变导致其编码蛋白的亚单位比例失衡，使编码蛋白的结构和功能发生改变，一方面影响微管聚合，导致染色体畸形和非整倍体形成，从而驱动肿瘤转移；另一方面可通过细胞骨架和微管聚合或G蛋白介导的对细胞粘合素信号反应的变化，引起细胞运动的改变，促进浸润过程［5］。也有学者认为nm23突变是导致其表达量减少的原因［10］。但本研究并未发现所有有转移浸润的癌组织中的nm23发生突变，其原因尚待研究探讨。
已有研究结果提示nm23表达阴性的患者生存期短，预后差。因此提示nm23表达的减少预示着不良的预后［5］。本研究也发现，nm23-H1及H2表达阳性的患者近期疗效好于表达阴性者，但作者尚未对患者进行远期的随访分析。因此，nm23的表达与卵巢癌患者预后的关系有待进一步的远期随访资料给予证实。
第一作者简介 李 力，硕士，副教授。
*项目受自然科学基金(39560081)资助
参考文献
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7 Sammons DW,Adams LD,Nishizawa EE.Ultrasensitive silverbased color staining of polypeptides in polyacrylamide gels.Electrophoresis,1981,2:135
8 Srivatsa PJ,Cliby WA,Keeney AL, et al. Elevated nm23 protein expression is correlated with diminished progression-Free survival in patients with epithelial ovarian carcinoma.Gynecologic Oncology,1996,60:363
9 Stahl IA,Leone A,Rosengard AM, et al. Identification of a second human nm23 gene,nm23-H2.Cancer Res,1991,51:445
10 Mandai M,Konish I,Komatsu T, et al. Mutation of nm23 gene,loss of heterozygosity at the nm23 locus and K-ras mutation in ovarian carcinoma:correlation with tumor progression and nm23 gene expression.Br J Cancer,1995,72:691
(收稿：1998-07-20 修回：1998-09-09)
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