禽H9N2亚型流感病毒能感染人的发现

中华实验和临床病毒学杂志 1999年第2期第13卷 论著

作者：郭元吉　李建国　程小雯　王敏　邹毅　李钏华　蔡访潺　廖华乐　张烨　郭俊峰　黄瑞敏　贝东

单位：100052　北京　中国预防医学科学院病毒学研究所(郭元吉　王敏　张烨　郭俊峰　贝东)；卫生部疾病控制司(李建国)；深圳市卫生防疫站(程小雯)；韶关市卫生防疫站(邹毅　黄瑞敏)；广州市卫生防疫站(李钏华)；汕头市卫生防疫站(蔡访潺)；佛山市卫生防疫站(廖华乐)

　　关键词: H9N2亚型流感病毒；感染；人

　　【摘要】　目的　了解禽(H9N2)亚型流感病毒是否能感染人。方法　对人、鸡和猪进行H9亚型毒株血清流行病学调查。对流感样患者和鸡咽喉部采样，用常规鸡胚双腔法分离流感病毒并进行毒株鉴定。对分离出H9N2亚型毒株的患者进行个案调查。结果　约19%的人含有对H9N2毒株的抗体，其HI滴度为≥20，从流感样患者中分离到5株H9N2病毒。结论　H9N2亚型毒株能自然感染人。

　　Discovery of men infected by avian influenza A(H9N2) virus　GUO Yuanji, LI Jianguo, CHENG Xiaowen, et al. China National Influenza Center, Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052

　　 　　【Abstract】　Objective　To understand whether the avian influenza A(H9N2) virus can infect men or not.Methods　Seroepidemiological surveys for avian (H9N2) virus in human, chickens and pigs were conducted. The specimens for viral isolation were taken from throat of patients with influenza like disease, as well as from chickens, then the specimens were inoculated into embryonated chicken eggs. Afterward, the idsolates were identified with HI and NI tests. Meanwhile, the patients who would be studied individually were found to carry H9N2 virus.Results　Approximately 19% of human had antibody to H9N2 virus with HI titers≥20, 5 strains of influenza A (H9N2) virus were isolated from the patients.Conclusion　Avian influenza A(H9N2) virus can infect men.

　　 　　【Key words】　Influenza A (H9N2) virus　　Infection　　Men

　　1997年5月11日至1997年12月28日，我国香港特区发生禽(H5N1)流感18例，其中死亡6例。通过病毒株基因分析认为是由鸡(H5N1)流感病毒传入人群所造成^［1］，同时推测是来源于我国内地的鸡群。由于这属国际上首次发现禽流感病毒能直接感染人并造成死亡，因此，迅速引起了全世界普遍关注，加上我国被公认为是流感的多发地，甚至发源地，故我国政府卫生部立即决定在我国内地，尤其与香港特区毗邻的广东省进行禽(H5N1)流感病毒普查及全面监测。由于H9亚型流感病毒在鸡群中分布广泛，故早已引起了我们的重视。果然很有意义的发现了禽(H9N2)流感病毒能自然感染人。据我们所知，这属国际上首次发现，而且H9N2亚型毒株在人群中分布广泛，故具有潜在的危险性，应及时加以报道，以便引起人们重视。

　　1　材料和方法

　　1.1　血清采集

　　1.1.1　鸡血清采集　于1997年12月～1998年10月分别采集于深圳、广州、佛山、云浮和汕头农贸市场，外表健康成年的当地鸡。

　　1.1.2　人血清采集　于1997年12月～1998年10月分别采集于深圳、广州、佛山、云浮、湛江、汕头、韶关、武汉和河北。除河北全部，深圳和广州部分血清为一般人群外，其余均为从事与生禽(鸡或鸭)及生猪有密切接触者。

　　1.1.3　猪血清采集　1998年11月采集于深圳市猪屠宰场，外表健康的肉猪。

　　所有血清由各单位各自采集并分离出血清，尔后，在冷冻状态下送国家流感中心进行抗体测定。

　　1.2　测定抗原　A/鸡/深圳/24/97(H9N2)和A/鸡/深圳/109/98(H9N2)病毒，均从深圳鸡群中分离出，经9～11 d龄鸡胚尿囊腔传代，其红细胞凝集滴度≥160并细菌培养阴性者作为测定抗原。

　　1.3　血清抗体测定　所有测定血清在测定之前，一律经常规RDE处理及终浓度为20%的鸡红细胞吸附，以去除非特异性抑制素和凝集素。然后，用常规的常量红细胞凝集抑制(HI)半加敏法进行测定。

　　1.4　病毒分离标本采集

　　1.4.1　鸡标本　于1997年12月～1998年10月分别从深圳、广州、汕头、韶关和湛江农贸市场外表健康的肉鸡，用棉拭子采集其咽喉部；用同法于1998年分别从北京、青岛、河北和河南病鸡(流感样疾病)中采集。

　　1.4.2　人标本　1998年1月～1998年10月采集于流感样门诊患者和住院病人的咽喉部粘液。

　　1.5　病毒分离　在当地卫生防疫站进行。按常规双腔法，每份标本接种2～4枚9～11 d龄鸡胚。凡所收获的鸡胚尿囊液或羊水出现红细胞凝集阳性的，均在当地暂冻存，尔后送国家流感中心进行鉴定。

　　1.6　鉴定血清　由WHO动物流感病毒研究与参照中心和国家流感中心所提供。

　　1.7　鉴定方法　病毒粒血凝素(HA)部分采用常规的常量半加敏HI法^［2］，而神经氨酸酶部分采用国际上通用的NA和NI法^［3］。

　　1.8　个案调查　由韶关和汕头市卫生防疫站分别负责进行。

　　2　结果

　　2.1　H9亚型流感病毒株血清流行病学调查

　　2.1.1　人群中血清流行病学调查，结果见表1。

　　表1结果表明，1 026份血清中对H9毒株的HI抗体滴度≥20者有197份，占19.2%，≥80者有30份，占2.9%。其次，从表1可看出，虽然不同地区人群中对H9毒株抗体阳性率不同，但都测出H9病毒的抗体。说明无论我国南方还是北方人群中，均已受到H9亚型毒株的感染。

　　那么H9毒株抗体在不同年龄组人群中分布有何特点?为弄清这个问题，我们在深圳和汕头采集了正常人体检不同年龄血清，将两地测定结果归总后列于表2。

　　从表2可看出，随着年龄的增长，抗体阳性率及其效价的几何均数而增高。经χ²测定，≤25岁3组间及26～60岁与＞60岁间P值均＞0.05，表明它们各自相互间无显著差异，但≥26岁的2组与≤25岁3组间，P值均＜0.01，表明它们相互间有显著差异。

　　2.1.2　鸡群中血清流行病学调查结果见表3。

　　表3结果指出，212份被检血清中，有23份对H9毒株抗体滴度达≥20者占10.8%，≥80的有7份占3.3%，除云浮由于份数过少未能查出抗体外，其余地区鸡群中均能测出。表明H9亚型毒株在我国鸡群中也具有广泛分布。

　　2.1.3　猪血清中抗体调查　调查结果95份猪血清对H9毒株抗体均＜10。

　　2.2　病原监测

　　1997年12月～1998年12月，从深圳、广州、汕头、佛山、韶关和湛江卫生防疫站及北京、河北、青岛和河南等兽医单位送检的从鸡群中分离出红细胞凝集阳性标本中，发现94份仅被H9亚型毒株抗血清有≥160效价的抑制，而不被其他亚型毒株抗血清抑制(HI效价均＜10)。接着随机从不同地区送检的毒株中随机取1/3进行其NA抗原部分鉴定。鉴定结果它们均被N2抗血清有≥160效价的抑制，而不被其他NA亚型抗血清所抑制，其NI效价均＜10。清楚表明所鉴定毒株为甲型流感病毒H9N2亚型，同时进一步证实了H9N2亚型流感病毒在我国鸡群中具有广泛的分布。

表1　人群中H9亚型流感病毒抗体调查结果

Tab.1　The results of serological survey for influenza A(H9) virus in human population

　　2　H9亚型毒株抗体在不同年龄组人群中分布

　　Tab.2　The distribution of antibody to influenza A(H9) virus in men of different age groups

　　表3　鸡群中H9亚型毒株抗体调查结果

　　Tab.3　The results of serological survey for influenza A(H9) virus in chickens

　　表4　5份人分离物鉴定结果

　　Tab.4　Identification results of 5 specimens isolated from patients

　　很有意义的是，从韶关和汕头送检的从流感样患者分离出红细胞凝集阳性的标本中，有5份当用人流感病毒：A/沪防/1/98(H3N2)，A/京科/262/95(H1N1)，B/京防/184/93，A/PR/8/34(H1N1)和A/Swine/Iowa/15/30(H1N1)抗血清进行鉴定时，其HI效价均＜10。而用H9病毒抗血清进行鉴定时，它们的HI效价均≥160，用标准的NA抗血清对其NA部分鉴定时，它们的NA活性仅被N2抗血清有≥160的抑制。表明这5份标本均为H9N2亚型流感病毒。这5份标本具体情况见表4。

　　为排除这5份分离物由实验室污染而来，患者患病之前是否与鸡有接触史，故进行个案调查，采集患者恢复期血清进行抗体测定。于1998年11月采集了患者血清(但1名汕头98-217无法采到进行HI抗体测定，测定结果：韶关98-408对H9病毒的抗体为≥160，隔1周后对患者进行第2次采血进行重复测定，结果与第1次测定的完全相同，但98-403患者血清的HI滴度＜10；汕头98-239HI抗体为30，而98-252HI抗体＜10。

　　流行病学调查表明，韶关75岁患者家附近就有一个农贸市场，14/12岁患者一家仅住1间房，床边就是一笼子活鸡；汕头1岁患者，其父血清中也测定对H9病毒有1∶30的HI抗体，但其母无法采到血清，36岁患者病前与鸡有接触史。3　讨论

　　一般认为流感病毒大流行株起源与动物流感病毒密切相关。然而，人与禽流感病毒不易在相互宿主间直接传播^［4］。但近来研究表明，在一定条件下，禽流感病毒能直接感染哺乳类动物^［5，6］，甚至人^［1］。

　　H9N2亚型流感病毒至今仅从禽分离到，但其分布广泛^［7］。然而，至今未见有人报道发现它能感染人。在毒株鉴定中发现，人与鸡的H9N2毒株极相似。故推测人的来源于禽，尤其鸡的H9N2毒株。虽然，香港大学Shortridge教授提到从香港猪群中分离到H9N2毒株(内部资料)，但未得到他人所证实，我们结果也未能证实H9N2毒株能感染猪。

　　为何4份血清仅有2份有抗体应答?韶关1岁的患儿，体质虚弱多病，免疫系统发育不完善，故难有抗体应答。但36岁患者为何无抗体应答?情况不清，患者拒绝再进行采血，实验无法进行重复。汕头1岁女孩估计由其父传给她的。虽然至今尚未发现H9N2亚型毒株具有人传人和造成流感暴发或流行的能力，但显然它具有潜在危险性。因甲型流感报道具有易变性和引起世界性大流行的能力。如果它长期如此广泛地感染人和鸡，就有可能在不久的将来，获得在人间的传播力或与人流感病毒发生基因重配出现新亚型毒株，在人间造成流感大流行。近来研究表明，1918年世界性流感大流行的病毒，先由禽传到哺乳类动物10～20年后，才引起人间流感大流行^［8］。故对H9N2毒株应百倍警惕。

　　(本工作得到了广东省卫生厅，广东省卫生防疫站大力支持及对武汉、云浮和湛江市卫生防疫站所提供的血清，在此一并深表谢意。)

　　参考文献

　　［1］Subbarao K, Klimov A, Katz J, et al. Characterization of an avian influenza A (H5N1) virus isolated from a child with a fatal respiratory illness. Science, 1997，279:393-396.

　　［2］郭元吉，程小雯.流行性感冒病毒及其实验技术.北京：中国三峡出版社，1997.PP.133-136.

　　［3］Herry AM, Coleman MT, Dowdle WR, et al. Influenza virus neuraminidase-inhibition test procedures. Bull World health Org, 1973, 48:199-202.

　　［4］Webster RG, Bean WJ, Gorman OT, et al. Evolution and ecology of influenza A viruses. Micro Rev, 1992, 56(1):152-179.

　　［5］Guo YJ, Wang M, Kawaoka Y, et al. Characterization of a new avian like influenza A virus from horses in China. Virology, 1992, 188:245-255.

　　［6］Scholtissek C, Burger H, Bachmann PA, et al. Genetic relatedness of hemagglutinins of the H1 subtype. Virology,1983, 129:521-523.

　　［7］唐秀英，田国斌，赵传删，等.中国禽流感流行株的分离鉴定.中国畜禽传染病，1998，20(1)：1-5.

　　［8］Taubenberger JK. 1918 pandemic-new date. Influenza ESWI, 1998,9:3.

(收稿：1999-02-08　　修回：1999-02-24)