用逆转录-聚合酶链反应鉴别甲型和乙型流感病毒感染

中华儿科杂志 2000年第9期第38卷 论著

作者：朱汝南　钱渊　刘成贵　万里涛　王芳　常汝虚

单位：朱汝南（100020　北京，首都儿科研究所病毒室 北京市感染与免疫中心实验室）；钱渊（100020　北京，首都儿科研究所病毒室 北京市感染与免疫中心实验室）；刘成贵（100020　北京，首都儿科研究所病毒室 北京市感染与免疫中心实验室）；万里涛（100020　北京，首都儿科研究所病毒室 北京市感染与免疫中心实验室）；王芳（100020　北京，首都儿科研究所病毒室 北京市感染与免疫中心实验室）

关键词：流感病毒属A，B；逆转录聚合酶链反应；微生物学技术

　　【摘要】　目的　建立快速、特异、有效的鉴别甲、乙型流感病毒的方法。方法　根据编码甲、乙型流感病毒膜蛋白M基因的核苷酸序列设计两对引物，将这两对引物用于同一逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，甲、乙型毒株的扩增产物分别为506 bp 和240 bp，根据这些产物在1.2%的琼脂糖凝胶电泳上的大小，即可鉴别所测毒株的型别。结果　用这一方法对我国24株甲型和5株乙型流感病毒分离株进行型别鉴定，分型结果与血凝抑制试验和核苷酸测定结果完全相符。结论　用上述根据M基因序列设计的RT-PCR方法鉴别甲、乙型流感病毒具有快速、简便、特异等特点，适用于流感病毒型别鉴定，可为临床诊断和及时制定防治措施提供依据。

Identification of influenza viruses types A and B by reverse transcription-polymerase chain reaction

ZHU Runan，QIAN Yuan，LIU Chenggui（Beijing Municipal Laboratory of Infection and Immunity, Laboratory of Virology, Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020，China）

　　【Abstract】　Objective　To establish a rapid, specific and effective technique for differentiating types A and B of influenza viruses in clinical isolates. Methods　Two primer sets were designed according to the nucleotide sequences of Matrix genes of influenza A and B. First strand of viral cDNA was synthesized from viral RNA by using oliogo-d (T)₁₈. PCR was performed with a mixture of the two primer sets specific for influenza types A and B, respectively. Amplified products were visualized in 1.2 % agarose gel containing ethidium bromide. Types A and B were differentiated by the sizes of the products (506bp for type A and 240bp for type B). Results　Twenty-nine isolates from clinical specimens which have been typed by hemagglutination inhibition (HAI) were identified by the method described above and the results of identified types of influenza viruses were consistent with those obtained with the HAI test and sequencing of the HA genes. Conclusion　The RT-PCR technique described here is simple, convenient, specific and therefore can be used for detection and identification of influenza viruses A and B in clinical isolates. It can provide a useful alternative to existing methods of influenza identification and offer the basis for clinical diagnosis, prevention and timely specific treatment.

　　【Key words】　Influenza virus A, B;　Reverse transcriptase polymerase chain reaction;　Microbiological techniques

　　流感病毒属正粘病毒科，其基因组由分节段、单股负链RNA组成，分为甲、乙、丙三个型别，均可引起人类急性呼吸道疾病^［1］。甲型流感病毒可造成世界性大流行，在历史上曾引起多次大规模的流行，都造成极大的损失。乙型流感病毒多引起局部流行，而丙型流感病毒常以散发出现，主要侵犯婴幼儿。甲、乙型流感病毒交替流行，涉及面广，对人群造成不同程度的危害，在婴幼儿、老年人和免疫抑制病人中有更高的发病率和死亡率。

　　目前，实验室常规检测流感病毒通常取呼吸道标本（包括鼻咽洗液和咽拭子）在鸡胚或组织培养中培养16～72 h后，使用免疫酶和免疫荧光法^［2,3］或血凝抑制试验进行鉴定 。这些免疫测定方法需要相当完整的靶抗原和型特异性的免疫血清，操作步骤繁琐。近年来聚合酶链反应（PCR）技术广泛应用于多种病原的检测，不仅可以用来扩增DNA模板，同样也是一种检测RNA分子的良好方法，包括乙型肝炎病毒、乳头瘤病毒和RNA病毒如人免疫缺陷病毒、轮状病毒等^［4-6］。本研究用逆转录-聚合酶链（RT-PCR）技术对流感病毒分离株进行型别分析，鉴别甲、乙型流感病毒，为临床诊断和及时制定防治措施提供依据。

　　材料和方法

　　一、 材料

　　1． 引物：根据编码甲、乙型流感病毒结构蛋白M基因的核苷酸序列设计两对引物，分别对甲、乙型流感病毒特异，期望对甲型流感病毒可扩增506 bp片段，对乙型流感病毒可扩增240 bp片段。(表1)。

表1　用于甲、乙型流感病毒分型的寡核苷酸引物

　　2． 试剂： (1) RNA尿素提取液: 见参考文献［7］；(2) 逆转录酶 (M-MLV)， 200 U/μl (BRL公司)；Taq酶， 5 U/μl(上海生物工程公司)；Oligo-d（T）₁₈，40 ng/μl; RNasin， 40 U/μl (华美公司)。

　　3． 流感病毒：24株甲型和5株乙型流感病毒从首都儿科研究所附属儿童医院和北京市防疫站的临床标本中分离；两株标准株由广州市儿童医院提供，均已经MDCK细胞或鸡胚培养阳性，血凝抑制试验鉴定型别。（表2）。

表2　用于分型鉴定的流感病毒

　　注：表中广儿院为广州市儿童医院；首儿所为首都儿科研究所；防疫站为北京市防疫站　　二、 方法

　　1．RNA提取：分别从400 μl 感染细胞或鸡胚尿囊液中提取RNA，用400 μl焦炭酸二乙酯处理的H₂O溶解RNA，见参考文献［7］。

　　2．DNA合成： 取5 μl 上述核酸加入1 μl Oligo-d(T)₁₈和7 μl H₂O，混匀后70℃孵育5 min。室温渐冷后加入5×M-MLV buffer， 3.5 mmol/L MgCl₂ ， 1 mmol/L dNTPs ， 5 U RNasin ， 100 U M-MLV ， 37℃ 孵育1 h。

　　3．PCR扩增： 50 μl 反应混和液包括上述cDNA合成反应液2 μl， 50 mmol/L KCl， 0.1% Triton X-100， 10 mmol/L Tris-HCl(pH 9.0)，1.5 mmol/L MgCl₂， 加入200 μmol/L dNTPs， Taq酶 2 U， 引物AMI、AMII、BMI、BMII各0.2 μmol/L。PCR反应条件为94℃1 min， 45℃ 1 min ， 72℃ 1.5 min，扩增30个循环，最后72℃延伸10 min。

　　4． RT-PCR产物的鉴定： 取5 μl RT-PCR产物在含0.5 μ g/ml溴化乙锭(EB)的1.2%的琼脂糖凝胶中电泳，在紫外灯下观察扩增后的DNA条带。RT-PCR反应设未经感染的MDCK细胞对照。

　　结果

　　一、 引物特异性

　　G29和G369两株病毒从广州市儿童医院患者标本中分离，已经国家流感中心鉴定为甲3型和乙型流感病毒。这两株病毒的cDNA经甲型和乙型M基因特异引物在一管一次的PCR扩增后，G29毒株产生506 bp的特异性片段，G369毒株产生240 bp的特异性片段，两株均无非特异性扩增片段。分型结果与血凝抑制试验结果一致，说明这两对引物特异性良好，无交叉反应性。(图1)。

M: PBR322/HinfI； 1和2：分别为G29和G369的扩增结果，产生特异的506和240 bp的扩增产物 ；3～23,28,30,31：分别为表2中甲3型和甲1型流感病毒的扩增产物，都为预期大小；24～27,29：分别为表2中乙型流感病毒的扩增产物；32：为未经感染的MDCK细胞对照

1　RT-PCR对流感病毒分离株型别的鉴定结果

　　二、 分离株鉴定

　　用两对甲、乙型流感病毒M基因特异引物同时作用于一管PCR反应中，对1996～1999年度首都儿科研究所附属儿童医院和北京市防疫站分离的29株流感病毒分离株进行型别鉴定。所有毒株均经血凝抑制试验鉴定型别，其中1998～1999年度分离株（M329，M330，Z91，F335）和1996年度分离株（X5，Wu，F373）的血凝素基因HA1区的核苷酸序列已经测定，为甲3型流感病毒。经RT-PCR扩增，这三个年度分离毒株的PCR产物与预期相符，即甲型病毒株均特异性扩增出506 bp片段，乙型毒株均扩增出240 bp片段。见图1。该方法不需要特异的免疫血清，可在8 h内确定结果，而且快速、简便、特异。

　　讨论

　　一、用M基因鉴别甲、乙型流感病毒的依据

　　流感病毒膜蛋白M1由其RNA第7节段编码，位于脂质膜内层，在病毒颗粒中含量最为丰富，不仅是病毒颗粒主要的结构蛋白，而且有可能对感染细胞中病毒的转录和核质运输方面起到调节作用^［8，9］。甲型流感病毒M基因编码252个氨基酸的M1蛋白。据报道，在过去的55年中，甲型流感病毒的M1基因编码区很少出现变异，非常保守^［10］。乙型流感病毒的M基因编码248个氨基酸的M1蛋白，同样相当保守。甲、乙型流感病毒的M1蛋白之间只有63个氨基酸相同^［11］，具有型的特异性，是流感病毒型划分的主要依据之一。本研究选用了M基因序列设计分型引物，保证了扩增的型特异性；同时又因为M基因相对保守，不受抗原变异和漂移的影响，可以长期地应用。

　　二、 本研究建立的方法的可信性

　　本研究建立的方法，以提取的病毒RNA作为模板，用Oligo-d(T)₁₈作为合成cDNA第一链的引物，使病毒的所有基因片段都有cDNA合成，这样就为下一步工作提供方便，可在此基础上用同一逆转录产物进行其他基因的分析。以M基因序列设计的引物进行分型鉴定的毒株经PCR扩增后，均产生预期大小的扩增片段，在琼脂糖凝胶电泳上可清晰分辨，无交叉反应。分型结果与血凝抑制试验和核苷酸测定结果完全相符。

　　三、快速、特异鉴别流感病毒的重要性

　　流感是第一个实行全球性监测的传染病，但是自首次分离流感病毒以来的近一个世纪，流感流行仍未得到很好的控制，主要原因在于流感病毒的抗原性尤其是血凝素和神经氨酸酶蛋白的抗原性经常不断地发生变异^{［12，13］}。迄今为止甲型流感病毒的血凝素已有15个亚型，神经氨酸酶有9个亚型。目前在人类广泛流行的甲型流感病毒仅限于两种亚型甲1（H1N1）和甲3（H3N2）。对人有致病作用的流感病毒主要是甲、乙两型，丙型流感病毒一般仅引起轻微症状。甲、乙型流感病毒交替流行，也可同时流行，涉及面广，对人类造成不同程度的危害。及时确定流感病毒的感染及其型别，将为临床诊断和预防提供依据。流感在高危人群中的控制有赖于病原的快速诊断，及时制定预防措施。鉴于抗病毒药物金刚烷胺对甲型流感病毒的复制有抑制作用，因此对甲型流感病毒的快速诊断有利于流行期的预防和急性期的治疗。本研究建立的鉴定临床分离株流感病毒型别的RT-PCR方法，不需要特异的免疫血清，可在8 h内确定结果，快速、简便、特异，为流感病毒的鉴定提供了新的思路，同时也为进一步建立检测和鉴定流感病毒的分子生物学方法奠定了基础，可为制定预防措施、及时使用流感病毒疫苗或抗流感病毒药物进行预防和治疗提供依据。目前，应用RT-PCR方法进一步鉴别甲型流感病毒分离株亚型和直接从临床标本中检测流感病毒的工作正在进行。

　　作者单位：常汝虚（广州市儿童医院病毒室）

参考文献

　　1，Lamb R, Krug RM. Orthomyxoviridae: the viruses and their replication. In: Fields BN.3rd ed. Philadelphia: Lippincott, 1996.1353-1395.

　　2，Ziegler T, Hall H, Sanchez-Fauquier A, et al. Type and subtype-specific detection of influenza viruses in clinical specimens by rapid culture assay. J Clin Microbiol, 1995,33:318-321.

　　3，Doller G, Schuy W, Tjhen KY, et al. Direct detection of influenza virus antigen in nasopharyngeal specimens by direct enzyme immunoassay in comparison with quantitating virus shedding. J Clin Microbiol, 1992,30:866-869.

　　4，Larzul D, Guigue F, Sninsky JJ, et al. Detection of hepatitis B virus sequence in serum by using in vitro enzymatic amplification. J Virol Methods, 1988, 20: 227-237.

　　5，Dickover RE, Dononvan RM, Goldstein E, et al. Quantitation of human immunodeficiency virus DNA by using the polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 1990, 28: 2130-2133.

　　6，Alfieri AA, Lelte JP, Alfieri AF, et al. Detection of field isolates of human and animal group C rotavirus by reverse transcription-polymerase chain reaction and digoxigenin-labeled oligonucleotide probes. J Virol Methods, 1999, 83:35-43.

　　7，Cane PA, Pringle CR. Molecular epidemiology of respiratory syncytial virus: rapid identification of subgroup A lineages. J Virol Methods,1992,40:297-306.

　　8，Martin K , Helenius A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: the viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell, 1991,67:117-130.

　　9，Watanabe K, Handa H, Mizumoto K, et al. Mechanism for inhibition of influenza virus RNA polymerase activity by matrix protein. J Virol, 1996,70-241-247.

　　10，Ito T, Kawaoka Y, Gorman OT, et al. Evolutionary analysis of the influenza A virus M gene with comparison of the M1 and M2 proteins. J Virol, 1991, 65: 5491-5498.

　　11，Briedis DJ, Lamb RA, Choppin PW. Sequence of RNA segment 7 of the influenza B virus genome: partial amino acid homology between the membrane proteins (M1) of influenza A and B viruses and conservation of a second open reading frame. Virology, 1982,116: 581-588.

　　12，Bean WJ, Schell M, Katz J, et al. Evolution of the H3 influenza virus hemagglutinin from human and nonhuman hosts. J Virol, 1992, 66:1129-1138.

　　13，Xu XY, Cox NJ, Bender CA, et al. Genetic variation in neuraminidase genes of influenza A (H3N2) viruses. Virology, 1996, 224:175-183.

（收稿日期：1999-12-01）